聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚合系统)

一、目的：>
1．学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。>
2．掌握聚丙烯酰胺园盘电泳的操作技术。>
3．比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。>
二、原理：>
（一）盘状电泳原理>
盘状电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2厘米），然后再进行电泳分离。>
盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性（discontinuity），凑巧分离出的区带也很象圆盘状（discoid>shape），取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。因此，英文名称为disc>electrophoresis，中文直译为盘状电泳。>
仪器装置：（见图15-1）。上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。上下槽的缓冲液中分别有正、负电极通入。上槽底部有很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。

这里仅以Davis和Orstein（1964）用分析血清蛋白的高pH的不连续系统为便 说明其基本原理。此系统是一个高pH的碱性系统，或称阴离子系统，最初用于分析血清蛋白，但也适用于其他的酸性和中性蛋白。很多细胞蛋白质，或病毒的结构蛋白在此系统中（pH8—9）解离成阴离子，向阳极移动。系统由下列三种不连续的凝胶组成。即在每支玻璃管中装有三层不同的凝胶（见图15-2）。最上层为样品胶，中层为浓缩胶（又称间隔胶或积层胶），下层为分离胶（又称电泳胶）。

在盘状电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应,使样品分离效果好，分辨率高。例如人血清用纸电泳(PH8.6)可以分成5—7个成分，而用盘状电泳也可分成20—30个条带清晰的成分（参看图15-3）。若采用不连续的浓度梯度凝胶柱，则可增至62个条带。又如人的唾液经盘状电泳。可分出10多个蛋白质条带（参看图15-4）。>
下面就盘状电泳过程中三种物理效应的原理加以说明。>
1．样品的浓缩效应：由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。>
（1）凝胶层的不连续性：三层不同的凝胶，其作用如下：>
样品胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，样品预先加在其中再聚合起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中。>
浓缩胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，有防对流作用。样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。>
分离胶：为小孔胶，一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离。也有防对流作用。>
蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。由于凝胶层的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。>
（2）缓冲液离子成分的不连续性>
在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方面泳动，其迁移率不同，两种离子若能形成界面，则走在前面的离子称为快离子（又称先行离子），走在后面的离子称为慢离子（又称随后离子）。为使样品达到浓缩的目的，需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小不相同的两种离子。并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相。即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。>
为了保持溶液的电中性及一定的pH，需加入一种与快、慢离子符号相反的离子，称为缓冲配对离子。使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中（即三层凝胶及电极缓冲液中）。例如分离蛋白质样品时，通常用Cl^-为快离子，NH₂CH₂COO^-为慢离子，采用三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）作为缓冲配对离子。

电泳开始前，如图15-5A所示，慢离子位于两个电极槽中，快离子分布在三层凝胶中，样品在样品凝胶中，缓冲配对离子位于全部系统中。电泳进行中如图 15-5B所示，快离子与慢离子的界面向下移动，由于选择适当的pH缓冲液，使蛋白质样品的有效迁移率（有效迁移率=mα，m为迁移率，α为解离度）介于快离子与慢离子的界面处，而浓缩成为极窄的区带。它们的有效迁移率按下列次序排列：m_clα_cl＞m_pα_p＞m_Gα_G（Cl 代表氯离子，P代表蛋白质，G代表甘氨酸负离子）。样品若是有颜色的，可以看到样品在界面处浓缩成极窄的区带。样品的分离，如图15-5C所示。当样品达到浓缩胶与分离胶界面处，离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，然后分成多个区带。

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