一、目的要求
1.学习电泳原理和技术
2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术
二、原理
>>聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；
(3)对pH和温度变化较稳定；
(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g
(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。>
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
(1)样品胶pH6.7>>>>> (2)浓缩胶pH6.7> (3)分离胶pH8.9> (4)电极缓冲液pH8.3
图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图
1.样品槽模板> 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽> 3.凹形橡胶框> 4.样品槽模板> 5.固定螺丝 6.上贮槽> 7.冷凝系统
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
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（1）样品浓缩效应
(a)凝胶孔径不连续性：
(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中
前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)
>尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
> mclcl
（c)电位梯度的不连续性：
(2)分子筛效应
(3)电荷效应
图4 电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
图5 不连续系统浓缩效应示意图
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
三、试剂与器材
试剂：10%SDS、 凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼脂糖溶液、0.05％考马斯亮兰R250 、7%醋酸
器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪> 、脱色摇床
