目的：规范生长激素中间体的电泳检测
一．仪器装置
1．电泳仪
2．夹心式垂直电泳槽
3．玻璃板：长14.5×11.5×2mm、短14.0×11.5×2mm
4．可调微量移液器
5．微量进样器
6．转移脱色摇床
二．试剂配制
1．丙烯酰胺液（30%T/2.7%C）
用天平分别称取58.4g丙烯酰胺（Acr）和1.6g N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis），溶于120ml温热（37℃左右，以利于溶解Bis）的去离子水中，然后转移至200ml容量瓶中，补加去离子水至刻度，摇匀，用滤纸过滤后，检查其pH值应不大于7.0，贮存在棕色瓶中，4℃保存。每隔2个月重新配制。
小心：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套。如不慎接触皮肤，应立即用水和肥皂清洗。
2．分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH8.8）
用天平称取36.3g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于160ml去离子水中，用HCl调pH值至8.8~8.9（先加5ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
3．浓缩胶缓冲液（0.5M Tris-HCl，pH6.8）
用天平称取12.1g Tris，溶于160ml去离子水中，用HCl调pH值至6.7~6.8（先加8ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
4．10% 十二烷基硫酸钠溶液
用天平称取20.0g 电泳级十二烷基硫酸钠（SDS），加180ml去离子水，68℃水浴使溶解后，用去离子水定容至200ml，室温保存。
5．10% 过硫酸铵溶液
用天平称取0.50g过硫酸铵（APS），溶于5ml去离子水中，分装Eppendof管冰冻保存。
6．四甲基乙二胺（TEMED）液
7．分离胶覆盖液（（0.375M Tris-HCl，pH8.8，0.1% SDS）
取分离胶缓冲液25ml、10% SDS溶液1.0ml，混匀，加去离子水定容至100ml，室温保存。
8．1% 溴酚兰指示液
用天平称取1.0g溴酚兰（BPB），加 0.05M NaOH溶液3ml使溶解，用去离子水定容至100ml。
9．2X样品缓冲液（0.125M Tris-HCl，pH6.8，4% SDS，20% 甘油，10% 巯基乙醇）
取浓缩胶缓冲液2.5ml、10% SDS溶液4.0ml、甘油2.0ml、巯基乙醇1.0ml、溴酚兰指示液0.5ml，混匀，分装Eppendof管冰冻保存。(生物秀实验频道 www.bbioo.com)
注：非还原型电泳中样品缓冲液不加巯基乙醇，其它均相同。
10．电泳缓冲液（0.05M Tris，pH8.3，0.384M甘氨酸，0.1% SDS）
用天平称取12.1g Tris，57.6g甘氨酸，加10% SDS溶液20ml，再加去离子水定容至2L。（此溶液一般可使用4~5次，当电泳胶染色后出现较多杂带和本底时，应重新配制。）
11．染色液储存液（1% 考马斯亮兰R-250）
称取2.0g考马斯亮兰R-250，加去离子水溶解并定容至200ml，滤纸过滤（以除去颗粒状物质）。
12．染色液（0.125% 考马斯亮兰，50% 乙醇，10% 乙酸）
取染色液储存液62.5ml、乙醇250ml、乙酸50ml，加去离子水至 500ml。
注：50% 乙醇也可用45% 甲醇代替，但甲醇毒性比乙醇大，不建议使用。
13．脱色液I（50% 乙醇，10% 乙酸）
取乙醇500ml、乙酸100ml，加去离子水至1L。
14．脱色液II（5% 乙醇，7% 乙酸）
取乙醇50ml、乙酸70ml，加去离子水至1L。
15．银染试剂
1）固定液（50% 乙醇，0.02% 甲醛）：取乙醇250ml、37% 甲醛270μl，加水至500ml。小心：甲醛蒸汽有毒，含有甲醛的溶液应在通风橱中配制。
2）1% 戊二醛液：取25% 戊二醛液20ml，加水至500ml。
3）硝酸银溶液（用前新鲜配制）：称取0.8g硝酸银，加水4.0ml溶解，将此溶液加到0.1M NaOH溶液20ml和25% 氨水1.5ml的混和液中，用水稀释至100ml。
16．银染显色液
取1% 柠檬酸2.5ml、37% 甲醛270μl，加水至500ml。
17．终止液（10% 乙酸）
取乙酸100ml，加水至1L。
三．操作方法
1．夹心式垂直电泳槽使用方法
1）清洗部件：用去污剂清洗长短玻璃板、胶模框及样品梳，用自来水彻底冲洗，再用去离子水不洗净，放置晾干或用滤纸擦干（注意不要留下纤维）待用。如有必要，也可先用5% KOH甲醇溶液（5g KOH溶于100ml甲醇）清洗玻璃板，再按以上步骤洗净。小心：KOH有腐蚀性，取用时应戴手套和面具。
2）组装电泳槽：
① 将四只固定螺杆插入带红色电极头贮槽框的孔中，然后将贮槽框仰放在桌上。
② 左手拿胶模框，右手从边上握住短玻璃板向下插入到胶模框的短槽（三边有槽的即是）内，然后以同样方法将长玻璃板插入到长槽（左右两边有槽的即是）内，注意手指不要接触玻璃板的凝胶面（以免留下油脂，使灌胶时产生气泡），压紧边框。
③ 将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐。
④ 将另一半贮槽框与桌上的贮槽框相合，并使胶模框上的凸出线位于贮槽框边的中间。
⑤ 装上四只螺母并拧紧，注意拧螺母时应用力均匀，最好用双手按斜线位置双双逐渐拧紧。
⑥ 将电泳槽垂直放于桌上，带短玻璃板的贮槽称上槽（阴极端），带长玻璃板的贮槽称下槽（阳极端），在玻璃板与胶模框间有一缝隙，此缝隙可用已熔化的2% 琼脂沿玻璃板外边两侧灌入，以防止漏胶。底部如留有气泡，可稍抬起一端，即可赶走气泡。（注意待琼脂完全凝固后才能倒入胶液灌胶。）
2．凝胶制备
1）15% 分离胶的制备
试剂名称 体积 终浓度
30% 丙烯酰胺液 5.0ml 15%
分离胶缓冲液 2.5ml 0.375M Tris-HCl
10% SDS溶液 0.1ml 0.1%
去离子水 2.4ml ——
10% APS溶液 60μl 0.06%
TEMED 6μl 0.06%
① 将上述试剂在小烧杯中依次混合。
② 一旦加入TEMED后，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物，使混匀后沿长玻璃板内侧缝隙加入（注意将长玻璃板内侧各处都沾湿，以防加隔离水层时水面不平），至与电极丝相平处，留出灌注积层胶所需空间（样品梳齿长加2cm）。
③ 用滴管在胶液上缓慢而小心地（切忌冲入下层胶液），加上一层约5mm厚的分离胶覆盖液（也可用水代替，可防止氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应），让其在室温下（最好在30~50℃）聚合（注意胶未凝聚前禁止摇动模具）。
④ 待胶凝聚后（水与凝胶层的界面消失后又再出现时，约15分钟），尽可能倒出覆盖液，用滤纸条吸干残留液体（注意不要留下纤维）。
2）4% 样品浓缩胶的制备
试剂名称 体积 终浓度
30% 丙烯酰胺液 1.35ml 4%
浓缩胶缓冲液 2.5ml 0.125M Tris-HCl
10% SDS溶液 0.1ml 0.1%
去离子水 6.0ml ——
10% APS溶液 60μl 0.06%
TEMED 6μl 0.06%
① 将上述试剂在小烧杯中依次混匀。
② 倒入模具中分离胶上，插入干净的样品梳（注意避免混入气泡），让其在室温下凝聚（约30分钟）。
3．样品处理
1）对照液：取一瓶 Genotropin (4IU)，加蒸馏水2ml，测A280应约为0.6（浓度约为0.6μg/μl）。取10μl与2X样品缓冲液10μl混匀，100℃水浴加热3分钟。上样量为10μl（约3μg）。
2）原料或成品：用蒸馏水配成1μg/μl的溶液，取10μl与2X样品缓冲液10μl混匀，100℃水浴加热3 分钟。上样量为10μl（约5μg）。
3）中间体液：
① 011、012样品：取样品液与2X样品缓冲液1:1混匀，100℃水浴加热3分钟。上样量为20~50μl，酌情加减，一般为30μl。
② 013样品：取样品液与2X样品缓冲液1:1混匀，100℃水浴加热3分钟。上样量为165/A280（μl），如下表：
A280 &3.5 3.5~5.0 5.0~6.0 6.0~7.5 7.5~9.5 9.5~13
上样量 50μl 40μl 30μl 25μl 20μl 15μl
注：当不知A280时，可按前一批上样量或上30μl。
③ 014、015样品：取样品液加1倍体积的水、2倍体积的2X样品缓冲液，混匀，100℃水浴加热3分钟。当A280&10时，上样量与同批013 样品相同，一般为30μl；当A280<10时，上样量为同批013样品的4/5。
④ 016S样品：将样品液稀释至A280≈1，取30μl与2X样品缓冲液30μl混匀，100℃水浴加热3分钟。上样量为30~40μl。
⑤ 016、017样品：将样品液稀释至A280为0.5~1.0，取30μl与2X样品缓冲液30μl混匀，100℃水浴加热3分钟。上样量为 20/A280（μl）。
⑥ 018sp样品：将样品液稀释至A280≈0.5，取30μl与2X样品缓冲液30μl混匀，100℃水浴加热3分钟。上样量为10/A280（μl）。
4．上样
1）上样前在已制好胶的电泳槽中倒入电泳缓冲液，液面高度应超过上槽短玻璃板的上缘5mm，下槽只要超过电极丝即可。
2）双手缓慢小心地取出样品梳，即可看到界线清晰的加样孔。如加样孔之间的胶条不平整，可用一平头针注射器校正。
3）用微量进样器吸取一定量已处理好的样品液或对照液，按预定顺序加入凹型凝胶加样孔中底部（注意校正胶条和加样时动作要轻缓，针头不要刺伤胶面）。每加完一个样品应用水洗涤进样器。不用的加样孔可加上等体积的1X样品缓冲液。
4）记下加样顺序。
5．电泳
1）用导线将上槽电极与电泳仪负极相连，下槽电极与正极相连。
2）当样品在浓缩胶中时，调节电压使电流为10~12mA（电压为80~100V）。
3）当溴酚兰前沿进入分离胶后，调节电压使电流 20~22mA（电压为100~200V）。
4）继续电泳至溴酚兰前沿接近分离胶底部3~5mm时（注意不要使染料逸出到下槽电泳缓冲液中），调节电压至零，关闭电源（整个过程需3~4小时）。
5）拆除导线，回收电泳缓冲液。
6．考马斯亮兰染色
1）染色：电泳完毕后，松开螺栓，取出胶模框，剥出玻璃板。用小不锈钢勺从浓缩胶一端轻轻撬开玻璃板（注意防止凝胶破裂），在凝胶右下角切去一小块以标注方位。用水将凝胶冲洗至一培养皿中，尽可能倒去水，加入考马斯亮兰染色液至浸没胶面，并除去凝胶下的气泡（否则脱色后有花纹），固定染色过液。
2）脱色：次日弃去染色液，水洗2~3次后，加脱色液I浸没胶面，置摇床上脱色，2~3次（3~4小时）后，再用脱色液II脱色2~3次（3~4小时），直到凝胶上背景脱净为止。水洗 2~3次，记录结果。
注1：为加快脱色速度，可采用以下方法：
a．用含30% 甲醇、10% 乙酸的混合液脱色。
b．用正常的脱色液在较高温度（如45℃）下脱色。
c．在正常脱色液中加入数克阴离子交换树脂或放入一块海绵，以吸附从凝胶上洗脱下来的染料。
注2：脱色越充分，考马斯亮兰染色检出的蛋白质下限就越低。一般脱色8小时，可检测到含0.25μg蛋白质的电泳带；脱色24小时，下限可低至0.1μg。
3）脱色后的凝胶可暂时保存在水中。如果保存在脱色液中，会使已染色的蛋白带脱色，此时可重新染色。
4）为保存永久性记录，可对已染色的凝胶拍照，或把已染色的凝胶干燥成胶片保存。为防止凝胶干燥后龟裂，可将脱色后的凝胶在保存液（25ml 87% 甘油加225ml脱色液II）中浸泡30分钟，然后用凝胶真空干燥器干燥成胶片。
7．银染
1）固定：电泳后立即将凝胶置干净的培养皿中，用固定液浸泡2小时，每小时换一次固定液。弃去固定液，用水浸洗1小时。弃去水，将凝胶置1% 戊二醛溶液中浸泡15分钟。弃去戊二醛溶液，再用水洗2次，每次15分钟。
2）银染：将凝胶置硝酸银溶液中浸泡15分钟，弃去硝酸银溶液，再用水洗3次，每次15分钟（注意清洗时必须防止凝胶表面干涸，否则会出现人为染色假象）。
3）显色：将凝胶置显色液中，平缓摇动5分钟左右（时间过长会导致凝胶出现较高的银染背景），待蛋白质条带显色后，置10% 乙酸中数分钟停止染色。用水洗3次，每次10分钟。
4）如欲保存，可按6.4) 下方法干燥（注意不要加温，否则会使银染色漂白）。
四．结果判断
1．通常，生产过程中的质量检验采用考马斯亮兰染色，最终产品用银染色。
2．做产品鉴别（还原型电泳）时，凝胶用双波长飞点扫描仪扫描，样品迁移率应与对照品一致。由样品与标准分子量蛋白的相对迁移率计算，样品分子量应为22,000。
3．做纯度分析（非还原型电泳）时，用双波长飞点扫描仪扫描，聚合物含量应不大于 5%，水解片断含量应不大于5%，单体含量（纯度）应不小于90%。
