一、实验原理
1、PCR
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。
ＰＣＲ技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。
PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理
2、16SrDNA的核酸序列分析
16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。
16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。
目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。
较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。
其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。
二、PCR标准反应体系
• DNA模板
• 引物
• 反应缓冲液
• dNTP
• ddH2O
• 耐热聚合酶
１．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。
２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。
３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。
４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。
５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。
６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。
７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。
８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。
PCR法的操作过程
Step 1: DNA热变性
Step 2: 引物退火
Step 3: 引物延伸
例如：
模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶催化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。
DNA模板
纯度：蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应
完整性： 模板降解会导致PCR扩增无产物
浓度： 加量过多导致非特异性扩增增加
引 物
特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体
完整性：避免反复冻融
浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少
三、反应体系对PCR扩增的影响
四、材料、设备及试剂
设备 ：eppendorf管、微量取液器， 台式 高速离心机， 电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、PCR仪
试剂：16SrDNA引物、细菌基因组DNA、Taq Plus、dNTP、 PCR 反应缓冲液、琼脂糖 、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA/HindⅢ 、EB 、 加样缓冲液
五、操作步骤
（一）、PCR反应
1. 依次混匀下列试剂
5μl 10×PCR反应缓冲液
1μl 4种dNTP
2μl 上游引物（引物１）
2μl 下游引物（引物２）
1μl 模板DNA
0.5μl Taq DNA聚合酶
38.5μl H2O
混匀后离心5秒。
（二）扩增：用94℃变性3分钟， 94℃变性1分钟，61℃退火1分钟, 72℃延伸1分钟, 循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下最后延伸5分钟，使反应产物扩增充分。
（三）电泳鉴定：方法同实验二（2%琼脂糖凝胶）
六、PCR常见问题分析
问题一：无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无；
问题二：非特异性扩增
现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
问题三：拖尾
现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
问题四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
现象：空白对照出现目的扩增产物
