1.0>>物品、试剂：>
10ul及200ul>Tip头、0.2ml>PCR薄壁管、管架、手套；>
DEPC处理水、Ex- Taq试剂盒（包括PCR>Buffer、MgCl2、Taq酶）、DNA>Marker均另购，>
引物/dNTP混合物(Primer /Nucleotide>Mix)、阳性对照DNA>(Positive>Control>DNA)、内标 DNA>(Internal>Control>DNA)>为普飞生物提供的VenorGem试用装中所含。>
2.0实验方法：>
2.1样品的准备：>
样品：细胞的新鲜培养物上清，小牛血清。>
分别取两种样品各100ul至灭菌1.5ml离心管中，将管盖盖紧。置95℃保温 5分钟，短暂离心（5>sec）。>
2.2>>试剂的溶解配制：>
将装有以下试剂干粉的离心管离心，向管中加入DEPC处理水，充分摇匀溶解后再短暂离心。以下为各组分的加水量：>
引物/dNTP混合物>(Primer/Nucleotide>Mix)>>>>>>>>55ul>
阳性对照DNA>(Positive>Control>DNA)>>>>>>>>>>>>50ul>
内对照 DNA>(Internal>Control>DNA)>>>>>>>>>>>>>>50ul>
2.3>>PCR混合物：>
向 0.2ml>PCR薄壁管中依次加入以下组分，
|
PCR组分（单位：ul） |
负对照管 |
内对照管 |
阳性 对照管 |
牛血清>检测管 |
发酵液 检测管 |
|
水 |
28.8 |
26.8 |
24.8 |
24.8 |
24.8 |
|
10×PCR Buffer |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
|
MgCl2（25mM） |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
|
引物/dNTP混合物 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
|
内对照DNA |
－ |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
阳性对照DNA |
－ |
－ |
2 |
－ |
－ |
|
处理后样品 |
－ |
－ |
－ |
2 |
2 |
|
Taq酶（5U/ul） |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
|
总体积 |
50 |
50 |
50 |
50 |
50 |
盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
2.4热循环程序：
将准备好的PCR管放入PCR仪，运行如下程序
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94℃ 2min |
1个循环 |
|
94℃ 30sec |
35个循环 |
|
55℃ 30sec |
|
72℃ 30sec |
|
降温至4~8℃ |
2.5凝胶电泳：
1.2％琼脂糖凝胶电泳，TBE缓冲液，PCR产物及Marker均点样5ul，于50V下电泳 1hr，EB染色15min，紫外灯下观察。
3.0结果分析：
电泳结果见图
图中泳道M为DNAMarker，1为负对照管PCR产物，2为内对照管PCR产物，3为阳性对照管PCR产物，4为牛血清检测管PCR 产物，5为发酵液检测管PCR产物。
负对照管PCR产物无带，内对照管在191>bp处有一条带，阳性对照管在278>bp处有一条带，证明本次实验准确可靠。两样品检测管均只有一条与内对照管相同位置的条带，说明样品检测管PCR反应并未受到抑制，且不含支原体。
