引言
对DNA片段在按特殊要求进行修饰上PCR技术提供了一种比原有技术更快更简单的 方法。因为与重组DNA技术相比，PCR技术本身就较为简单;而且它还可以通过化学合 成寡聚核苷酸引物的方法更为简便地改变DNA的碱基序列，而不需对DNA片段进行限制 性内切酶和连接酶操作;再者，PCR技术还可能很方便地进行序列改造，如在引物5'端 加上一个“添加”序列(add-on sequences)。此外PCR技术产生的修饰产物效率几乎 可达100%。
Scaharf等人首先提出PCR技术可以很方便地将酶切位点导入DNA片段中，这只需 将这些序列加到寡核苷酸引物的5'-末端上。虽然这些序列与模板DNA是不朽对的，但 在大多数情况下，它们几乎不影响扩增的特异性和扩增效率;特异性显然是由内引物 的3'-末端决定的。当带有这些“添加”引物的DNA链进行在我复制时，这些添加的内 切酶位点序列也就“安装”到由此而扩增出的PCR片段中，目前已有人报道长达45个 碱基的添加序列。
通过PCR引物引入DNA序列变异的原理是非常有用的。最为简便的是它可以使PCR 产物的一条链或另一条链或两条链都特异性地标记上放射同位素、生物素或荧光素。 它还可以在DNA序列的任一位置上进行改变，或用来在任何所需的连接点进行DNA序列 的重组。本章主要就是讨论这些步骤。
用引物标记PCR产物
用γ-32P-ATP直接将一个PCR引物磷酸化(Kinasing reaction)，然后在标准PCR 反应中直接使用标记的引物来扩增出一端带有标记的片段。将这种末端标记法应用到 通过Maxam-Gilbert或磷酸硫代化学法对产物进行直接测序，以及合成一些适用于进 行蛋白质的结合/保护分析(binding/protection assays)或“足迹法”的DNA序列。PC R技术是一种在体外合成用于蛋白“足迹法”分析所需DNA片段的简便方法。蛋白“足 迹法”分析不依赖限制性内切酶位点并且比限制性内切酶位点并且比限制性内切酶片 段的分离和末端标记更为简便。
生物素可以标记到一个寡核苷酸引物的5'-末端上，其结果并不影响PRC反应。这 为用抗生蛋白链菌素─或抗生物素蛋白─酶共扼物检测杂交PCR产物提供了一个非同 位素法，它还可以用抗生蛋白链菌素柱(Streptavidin─columns)将产物的一条链与 另一条链分开;此外，它还可以对PCR产物进行定量。同样，也可制备用荧光标记的寡 聚物并应用在PCR技术中。带有不同荧光标记的特异性引物可以区分从不同位点扩出 来的PCR产物。
在PCR产物的末端导入有用序列
如图1所示，内切酶的识别位点可被加到单个或两上PCR引物的5'端上。这些位点 有助于扩增片段插入到克隆载体中。在扩增产物的两端加上不同的酶切位点，产生的 特异性的粘性末端就可直接进行克隆转化。在设计“添加”内切酶位点的序列时，最 好在标准识别序列的5'末端另外再多加几个碱基，以免处于片段最末端的酶切位点可 能不被内切酶所识别。文后的操作指南A就是关于将PCR产物的这种位点上进行酶切， 并用连接酶将产物插入克隆载体的操作步骤。用这种方法加到PCR片段的其他序列还 有RNA聚合酶的启动子。这些富含G+C序列是为了增强变性梯度凝胶电泳的分辩力，以 使它能区别出单碱基差异的不同片段。
由PCR产生的突变和重组
Mullis等指出PCR技术可以用来“装配”重叠寡核苷酸使之成为很长很长的PCR产 物，从而获得比用直接化学合成法具有更多产量的全合成DNA模板的两年PCR产物准确 地连接起来。如图二所示，从同一模板的不同区域扩增出来的两个PCR产物，经过这 样处理后，得到的片段在序列上能相互重叠。这些产物可经过混合，变性及退火。在 异源双链中有一条链在3'-末端发生重叠，利用与其5'-末端配对的引物，来扩增这个 异源杂合双链，我们就可以从由两上次级PCR产物准确地连接成的片段混合物中调出 一个片段(按Mullis的说法)。由于特生的扩增，PCR反应中的绝大多数产物是我们所 需的重组DNA片段。
通过引物导入的序列变异因化学合成的引物长度有限而受到限制，但此法与PCR 片段连接法组合使用，可在片段的任一位置引入变异，而不仅仅是在其末端引入。重 组所需的重叠序列不必存在于天然模板，可设计成添加序列进入引物。这样，通过 PCR技术几乎可在DNA片段任何位置上特异性地进行位点替代、缺失和插入，同时它还 可以将本来毫不相关的序列准确地连接起来。
图二.位点特异性突变和利用序列重叠来组合PCR片段。箭头表示靠近于它们在靶 DNA序列退火位点上的寡核苷酸引物。两个中间或叫内侧引物与靶序列有一个碱基错 配，它们退火到靶DNA链的同一部位，但引发合成的方向相反。错配导致了在两个初 级PCR产物中发生同样的序列变异。PCR1和PCR2是分别进行的，产物从过量的引物中 分离出来，然后混合，变性再退火。有些分子如图所示通过中间引物的重叠而重组。 带有内陷3'-末端的DNA链的重组体的延伸将产生一个可以用原来的外侧PCR引物扩增 的分子，这两个引物可调出在远离其末端有一个特异性碱基变异的DNA分子。
图三.由PCR产生插入、缺失和序列重组。A:互补的两个引物，可以用将一小段插 入序列带入两个重叠PCR片段的末端。(插入子由环状表示，注意:如图所示:插入序列 不一定于引物的5'-末端。)如图二所示:可通过组合两个重叠的PCR片段，将插入子序 列可通过PCR合成一完整插入片段，将其与两侧的PCR片段连接，如(C)所示。B:通过 重组重叠PCR产物，重叠引物可使靶基因上的一段序列丢失。C:重组PCR法，毫不相关 的PCR片段，可以通过在5'-添加互补重叠序列而重组在一起。重叠PCR片段的组合如 图二所示。
这些过程详见图二、图三。图二显示了以错配的形式在引物和靶序列之间引入一 个特异性的替换碱基。通过使用重叠PCR，这个替换的碱基就被移到DNA片段的中央。 图三A显示了将一个小插入片段作为添加序列加到引物上。在这个方案中，插入子的 大小受到引物长度的限制。不过要获笪长的插入片段，可先把完整插入序列做成一个 PCR产物，然后通过重叠引物使之与边侧序列组成。图三B图示了可用来产生缺失的重 叠引物。图三C表明重叠添加序列是如何将一个假定的启动子结合到基因序列上的。 将不同的序列组装丐来的PCR技术称为“重组PCR”，该方法详见操作指南B。
有报道用这种PCR方法可将替换位置于300-800bp的PCR片段的中间部分。Vallette 等也报道了用添加序列的方法来获得插入和缺失。Horton等准确地将四个不同序列重 组最终产生一个970个碱基的DNA片段，该片段编码镶嵌型小鼠第一类MHC蛋白。Hortor 称这种方法为SOE，或重叠延伸拼接法(Splicing by Overlap extension)。
PCR反应中的无用突变
若PCR产物是用在集合(aggregate)反应中，那么在扩增过程中产生的低水平、随 机的突变并不影响最终结果，因为绝大多数分子在任意位点上的核苷酸都是正确的。 然而，若PCR产物是用来克隆的，例如克隆入表达载体，那么克隆在载体中的分子若 在序列上发生不需要的变异将影响最终结果。这是用PCR方法与重组DNA方法相比最为 严重的弊端。
在一个逆向反应中，已经分析出Taq DNA聚合酶每9.000个核苷酸中就存在一个错 误掺入的核苷酸，每41.000个核苷酸中就将发生一个移码突变。预料，PCR反应经过 20次复制倍增(Doubling)后，将使DNA分子随机突变为900个碱基发生一次。然而，在 PCR条件下的错误掺入，并不一定总是在最终产物中产生序列差异。虽然Taq聚合酶没 有3'到5'的外切酶校正功能，使得错误掺入的碱基不能被除去，但它可使延伸的DNA 链终止。在这种情况下，这些错误将不会在随后的PCR循环中蔓延。
对已经克隆的来自同一扩增出反应的PCR产物，测序结果表明序列突变频率较 大。一项研究比较了PCR扩增出的HLA基因序列的克隆，发现在大约25个倍增复制后， 平均400个碱基中就有一个发生错误掺入。然而，Goodenow等21检查PCR扩增的HIV序 列的克隆子，发现克隆子之间的序列差异至少比同样数目倍增复制产物少10倍。HoT Horton等人采用限制循环次数也对这种物异性突变进行研究，分别发现:在3900个碱 基的序列中有一个无用的突变，及在1800个碱基的序列中有一个。这个比率还是可以 接受的。造成这些变异的原因目前尚不清楚。复制倍增次数、扩增的条件以及需扩增 的序列长度等可能影响无用突变频率。
从目前情况看，进行反应的dNTP浓度最好在50-200mmol之间(太高的浓度将产生 错误掺入)，引物的退火温度应尽可能地高(这样错误掺入就更可能导臻链的终止)， 滞留在高温下的总反应时间也应尽可能地短，以防止DNA被降解而产生更多的错误掺 入，因而要使用最少的PCR循环。在使用PECI热循环系统时，变性温度一般为30秒就 足够了。对于小于1kb的片段，引物退火和链延伸的时间最多为30秒。
由于PCR产物中突变多少是与已经发生突变DNA复制次数成正比的，因而最好采用 最少PCR循环制备出足够的DNA量。所以起始反应就需要尽可能多的模板。值笪注意的 是:理论上，在10次复制倍增和20次复制倍制之间产间错误掺入频率仅两倍之差，但 在实际扩增中，却是1000倍的差异。
在这方面开展了大量的工作及实验，建议用经过测序验证没有无用突变的PCR产 物进行克隆。对于较小的靶基因，非理想突变发生几率也较小。par小结
在PCR技术的应用中，着重于使用直接休学修饰的PCR引物在扩增片段中导入所需 的变异。它是在DNA片段末端加入标记和/或新的序列的最简单途径。它也可在两个 PCR产物之间另创一个重叠序列而使它们很容易地进行重组。
在新的大分子研究中，重组PCR(将组合PCR片段的反应都归入这个名词下)是一个 具有潜力而有效的新方法。它能很容易地产生特异性的新DNA重组序列。重组DNA法还 大大地简化了检验由这些基因编码的新蛋白的工作。人们可以想象PCR产物可以直接 进行体外转录/翻译。若目的蛋白活性可以特异地、灵敏地进行检测，那么体外产生 的蛋白数量可能就足够用来检测所需的特性。最令人满意的PCR产物就可以高产率地 进行克隆和表达。
操作指南A:用添加内切酶位点来克隆PCR产物
限制性内切酶的隆解:
1.混匀25μlPCR反终产物，10μl合适的10X内切酶缓冲液(若同时使用两种不同 的酶，为了直接进行克隆，若可能的话用一种适合于两种酶的缓冲液，这些限制因素 在设计添加位点时就必须考虑)。加入5-10单位的内切酶，用蒸馏水补到100μl。
2.在合适的温度下酶解2-3小时。
3.如果内切酶是热不稳定的，用70℃加热使酶变性失活，若是热稳定的，用等体 积的缓冲液饱和酚来抽提。
制备要连接的限制性酶切DNA
PCR产物中的dNTPs可以抑制连接反应，而且连接前DNA也需进行浓缩，用醋酸 胺、异丙醇来纯化DNA或用“Glassmilk”来吸附及洗脱纯化。
在10μl反应体系中，加入25%已纯化的DNA，和200ng酶切载体DNA进行连接。
连接后，用酚抽提，乙醇沉淀有时可以提高转化效率。
操作指南B:用PCR进行特异性的突变和重组
引物设计
通常引物中至少有15个碱基与靶序列相互补，而靶序列的3'-末端可以与任何添 加序列发生错配，单个碱基错配除引物3'-末端处3-4个碱基外，其他地方都可引入。 在PCR产物之间提供重叠的添加序列至少要有15个碱基，当然越和越好，这样它将使 重叠的杂合分子稳定。
原初PCR(PrimaryPCRs)
如上所述，为了避免非理想突变，应该用尽可能多的模板DNA。但必须注意，带 有或不带有所需突变的PCR产物的量与起始模板的量成正比，而这些DNA又可带入随后 的重组PCR反应中。若可能的话，这个比率可以通过纯化“原初”PCR产物而教师到降 低。在达到“平台期”(Plateau)之前，用尽可能少的PCR徨来产生足够量的PCR产物 也是个好办法。
从PCR中除去过量的引物
为了得到理想的组合PCR产物，必须从原初PCR产物中除去重叠引物或“内侧”引 物，然后加入“外侧”引物。用Centricon100的选择性过滤可以很容易地分开PCR产 物和引物，具体操作如下:
1.在Centricon100贮样器(Reservour)上部，将10-50μl原初PCR终产物加到 2mlTE(10mMTris-HClpH8.0，0.1mMEDTA)中，用石蜡膜盖封，颠倒混匀。
2.1000g离心25分钟，先滤出引物。再用大于1000g的速度离心。超过1000g的离 心力会使部分产物透过滤膜。再加入2mlTE到Centricon100中，重复离心。
3.重新悬浮PCR产物(大约40μl)
此外，PCR产物也可以用凝胶电泳来纯经，它有除去原初靶DNA的优点。
重组PCR
将原初PCR产物混合后，重叠分子的生成及延伸将在PCR条件下发生。用尽可能多 的PCR产物，以限制DNA复制的倍增次数和减少非理想突变发生。如果可能的话，作为 一个阳性对照反应，应确证外侧引物确实从未突变的模板中扩增了DNA片段(如果打算 事先将不相关的旬结合起来是不可能的)
