徐 丽 蔡俊鹏
(华南理工大学食品与生物工程学院，广东广州510640)
摘 要：为建立一种快速、经济、敏感的PCR检测方法，以直接检测出环境、海产品等中的靶基因，通过PCR扩增已知携带tlh和tdh基因的副溶血弧茵标准菌株，并和常规PCR方法比较，初步建立了茵落PCR技术；再以副溶血弧茵标准菌株为阳性对照，以本实验室自海洋环境中分离得到的数株野生菌株为检测对象，采用新建立的茵落PCR 以及常规PCR 方法对它们进行扩增比较，进一步证明了茵落PCR技术检测携带相关基因菌株的可靠性．通过比较，发现茵落PCR和常规PCR的结果相当一致，两种方法均能扩增出阳性对照标准菌株中tlh和tdh基因． 关键词：茵落PCR；常规PCR；tdh基因；tlh基因
PCR是一种快速、特异性地扩增某片段DNA 的分子生物学技术，自其发明以来，已在国际上得到了广泛的应用．常规PCR扩增前需制备、纯化DNA 模板，其方法主要有酸酚法、碱酚法、碱性SDS裂解法、CsC1 一溴化乙锭密度梯度离心法和煮沸裂解法等-- ．它们各有优缺点，有的操作较繁，难度大；有的则成本较高．例如，酚一氯仿抽提法是一种经典方法，这种方法需要通过蛋白酶K 的消化及有机试剂酚、氯仿的抽提，而最终获得基因组DNA．这种方法虽可以获得质量较高的DNA，但操作繁琐，耗时较长，且需要昂贵的试剂及一些特殊处理．同时在反复的操作中DNA量损失也较大，产率较低，故需要较多量的菌种材料．另外，一些试剂本身如酚、氯仿等不仅对DNA有害，而且如果残留，也会对PCR反应中的Taq酶产生抑制作用 ．
菌落PCR 方法最早见于D．Gussow 和T． Clackson 的文章．他们提到，用无菌牙签挑取单个菌落到TE缓冲液中，煮沸5min，漩涡振荡后短暂离心，用1～2 L裂解液作为DNA模板．省去抽提模板DNA这一步，节省了大量时间和实验成本，不失为一种经济、快速、准确的好方法
本实验采用的菌落PCR方法，将样品跳过DNA 抽提这一步，而直接以菌体热、冻解后暴露的DNA 为模板进行PCR扩增，不仅节约了时间，增加了设备利用率，同时也降低了实验成本．本实验采用副溶血弧菌的不耐热溶血素(tlh基因)和耐热的直接溶血素(tdh基因)作为扩增对象．不耐热性溶血毒素 (Thermolabile hemolysin，简称tlh)是副溶血弧菌产生的毒素之一，tlh不但溶解人的红细胞，而且溶解马的红细胞，生化实验证明tlh是一种非典型的磷脂酶，但其功能和致病性仍不清楚 ．耐热的直接溶血 tdh基因是目前公认的副溶血弧菌的主要致病因子，它一般存在于对人体有致病性的副溶血弧菌中。
本研究使用常规PCR和菌落PCR对其进行扩增，并以其为阳性对照，对其他几株菌株是否含有该两靶基因进行检测，分别作了介绍．
