1 目的
分子标记是一类建立在分子水平上的遗传标记，它同样具有遗传标记的两个特点，即可遗传性和可识别性。广义的分子标记包括同工酶和DNA分子标记两类，狭义的分子标记则仅指后者。DNA分子标记通常是一些小分子量的DNA片段（几十到2000bp左右），它们大量存在于真核生物的基因组内，能够通过特定的技术和方法进行检测。多数情况下，这些DNA片段（即分子标记）本身并不是基因，也不是基因的一个部分，但它们往往与目的基因（目的性状）有连锁关系。利用这种连锁关系（越紧密越好），就可以对目的基因进行识别和分离、对目的性状进行早期预选、对优良基因进行聚合，从而大大促进园艺植物的育种工作。DNA分子标记的种类很多，常用的有RAPD（随机扩增多态性DNA）、RFLP（限制性片段长度多态性）、AFLP（扩增片段长度多态性）、SSR（简单序列重复）等，本实验主要介绍RAPD分析的实验方法，通过实验了解RAPD分析的基本原理，认识和掌握RAPD分析在园艺育种中的应用及实验操作技术。
2 原理
虽然DNA的基本单元是一个个的单核苷酸，但在只含有模板和单核苷酸（dNTP）的反应体系中，DNA聚合酶（Taq酶）并不能启动聚会反应，这是因为该酶催化的反应是一种延伸反应，即只能在已有的DNA链的3’-OH端掺入单核苷酸，形成磷酸二酯键，合成方向为5’→3’。因此，还需要在反应体系中提供特定的DNA短链（称为引物），用以启动DNA的聚合反应。
常规的PCR扩增过程为：① 将反应体系（模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA聚合酶，引物1和2都是特异合成的长度为15－30核苷酸的单链DNA）置于高温（94℃）下变性，使模板双链DNA解链为两条单链；② 在低温（50－60℃）下退火，使引物与模板链3’端互补区结合形成部分双链DNA；③ 在中温（72℃）下延伸，Taq DNA聚合酶根据模板的核苷酸顺序，将单核苷酸从引物的3’端顺次掺入，催化磷酸二酯键生成，实现新链的延伸。经过如此的变性、退火和延伸三步构成的一个循环，可使两种引物限定范围内的DNA序列扩增一倍。由于每次循环的产物都能成为下一循环的模板，因而PCR产物量以指数方式增加，从理论上计算，经过 22个循环，目的DNA片段可被扩增到106级。
RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）是一种建立在PCR技术基础上、可对整个基因组进行选择性扩增的分子标记技术。它是以一个随机合成的10寡核苷酸为引物，在未知序列的基因组 DNA上，对部分DNA序列进行随机扩增，产生长度不同的DNA产物，通过电泳分离和EB（溴化乙锭，有剧毒）染色，显示出扩增的DNA条带。一般来讲，只有当模板DNA链上不太长（≤2000bp）的区域内，存在2个与随机引物反向互补（基本或完全互补）的序列，这一段DNA片段才能被扩增，其数量也是以指数方式递增。RAPD与常规PCR的不同之处是：① 所用的引物比较短，为随机合成的10寡核苷酸单链；② 扩增反应中只用一个引物，但实际起到两个引物的作用；③ 扩增循环中所用的退火温度较低（35－40℃），以利于多态性（多个片段）的检出。
由于DNA聚合酶（Taq酶）的聚合能力和琼脂糖凝胶的分辨能力的限制，RAPD片段的最佳长度一般为400～2000bp左右。
3 实验材料
通过实验一制备得到的质量合格、浓度准确（5μg/μL）的园艺植物基因组DNA溶液，建议编为1号，老师另外提供4个DNA样品，即YY2（元阳二号荔枝）、YYJ（元阳焦核荔枝）、HZM（双季龙眼）和ZSG（四季龙眼），建议编为2～5号。
4 主要仪器设备（斜体示必须设备）和实验用具
PCR扩增仪(Pekin Elmer公司)，高速冷冻离心机(Beckman公司)，低温高速离心机（Eppendorf公司），DU-640紫外分光光度计(Beckman公司)，电泳系统(BIO-RAD公司)， 凝胶成象系统(BIO-RAD公司)。 移液枪，灭菌的PCR管、离心管、吸头等。
5 主要试剂
灭菌的ddH2O；10×buffer缓冲液（不含MgCl2）；25mM MgCl2溶液；dNTP（每种2.5mM）；
随机引物经准确定量后，取少量用ddH2O稀释成5μM溶液，-20℃下保存备用；
模板DNA经准确定量后，取少量用ddH2O稀释成5ng/μL溶液，4℃下保存备用；
Taq酶液（2-5 U/μL）；TBE电泳缓冲液；载样缓冲液（6×或10×）；
琼脂糖（BIOWEST）；EB染液。
6 实验步骤
（1） 每5人为一组，每人取5个0.2ml的PCR管，按顺序写上编号。
（2） 配制RAPD扩增的反应液，各组份的用量及终浓度如下表：
如果是做多个反应，可将所用的相同组份一次取样、混合后再分装至各个反应中。本实验中，每组用1种引物，每人做5种模板，每组共做25个反应。操作时，需另取1个1.5ml的PCR管配制混合液，然后分装到25个管中，每管分装量为22μL（由一位同学操作）。注意：模板DNA不与其它组份混合，需预先加到5个管中。
组份
体积（ 1 个反应）
终浓度
25 个反应
ddH 2 O
经验值为 18.6 μ L
10 × buffer 缓冲液
（含 20 mM MgCl 2 ）
2.5 μ L
1 ×
2.5mM dNTP
1.0 μ L
0.1mM
5μM 随机引物
1.0 μ L
0.2 μ M
模板 DNA
3.0 μ L
约 15ng/25 μ L
Taq 酶（ 2 U/ μ L ）
0.5 μ L
1U/25 μ L
总体积
25 μ L
（3） RAPD扩增：配制好反应液后，放入PCR仪中进行扩增反应，扩增程序为：94℃ 5′（预变性）；94℃ 40″→38℃ 1′→72℃ 1′（40个循环）；72℃ 10′（后延伸）。
（4） 制备1.5％的琼脂糖凝胶：称取适量琼脂糖、量取适量TBE电泳缓冲液，混合后于微波炉中加热至溶化，补充蒸发的水分，制备得到浓度准确的琼脂糖凝胶，适当冷却后小心倒胶，待凝胶板完全冷却后，小心拔去梳子，将胶板放入电泳槽中，加电泳液淹没胶面。本实验中，需制作3-4块300ml的琼脂糖凝胶。
（5） 电泳、染色及观察：
在每个反应产物中，加入适量的载样缓冲液，混合均匀，得到混合物；
于每个梳孔中，点加适量的混合物（10-20 μL），每排梳孔中最左边的梳孔用于点加DNA Marker（分子量标记物），以便计算分子量；
以2～3V/cm的电压进行恒压电泳，待溴酚蓝条带泳动至凝胶底端时停止电泳；
将凝胶没入EB染液中染色1～2h，用自来水冲洗后于凝胶成像系统上扫描成像和保存，供进一步的分析之用。
