>mRNA差异显示技术是由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所的Liang Peng博士和Arthur Pardee博士在1992年创立的 [3]。它也称为差示反转录PCR（differential display of reverse transcriptional PCR）简称 DDRT-PCR。mRNA差异显示技术是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品[4]，该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。其基本原理是，几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P. Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个 mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段（如图1）。
随着mRNA差异显示技术的广泛应用，也逐渐显露出一些不足之处，如所得特异性cDNA片段克隆的假阳性的比例较高，差异条带分离困难，获得的差异扩增片段一般在100bp~600bp太短之间，包含大量的非编码序列，不利于同源性比较分析等。
以下是以红豆杉为例进行mRNA差异显示研究的具体操作。
图 1 DDRT-PCR原理图
1实验材料
1.1红豆杉细胞
未经MJ诱导处理的A&1<和经MJ诱导处理的B&1<红豆杉细胞。
1.2 寡核苷酸引物
（1）3’锚定引物：
①H-T11A(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’
②H-T11C(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’
③H-T11G(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’
（2）5’ 随机引物：
Kit引物：
①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTGATTGCC-3’
②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCGACTGT-3’
③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’
④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTCTCAACG-3’
⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’
⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGCACCAT-3’
⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTAACGAGG-3’
⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTTACCGC-3’
生工引物：
①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’
②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’
③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’
④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’
⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’
⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’
⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’
⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’
特异引物：
①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’
②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’
③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’
④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’
⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’
⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’
⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’
1.3主要试剂
（1）RNA提取
柠檬酸钠(Sodum citrate)，十二烷基肌氨酸钠(N- lauryl sarcosine），巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，异硫氰酸胍 (guanidine isothiocyanate)， 焦碳酸二乙酯(DEPC)，水饱和酚等购自上海生工生物工程有限公司。
（2）逆转录及PCR扩增
SuperscriptTMⅡ试剂盒(Cat No:18064-022，Invitrogen公司），GIBCO BRL公司；RNAimage试剂盒，GenHunter公司；Taq DNA聚合酶和dNTPs，华美生物工程公司；寡核苷酸引物，上海生工生物工程公司合成；其它试剂均为国产分析纯产品。
（3）PAGE凝胶检测
100bp DNA ladder(Cat No:MG0911), 华美生物工程公司；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，BIOMOL公司；其它试剂均为国产分析纯产品。
1.4主要仪器
PTC-100基因扩增仪（Techne公司，英国），GeneGenius 凝胶成像系统（SYNGENE公司，美国）。-70℃超低温冰箱(Thermo Forma，美国),PCR超净台(基因有限公司，美国),DYY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂), 5810R低温冷冻离心机(Eppendorf，德国),Micro-MB3616型高速离心机(IEC公司，美国),Vortex GENIE2(基因有限公司，美国),GeneQuant核酸定量仪(Pharmacia Biotech 公司,英国)。 CS101-2A电热鼓风干燥箱（银河，中国重庆），DYY-111 12型三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂），DYY-111 20A型DNA序列分析电泳槽（北京六一仪器厂），TY-80A脱色摇床（北京六一仪器厂）。
2 实验方法
2.1 总RNA的提取与检测
（1）用品的准备
塑料器皿，如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的 DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌后4℃保存；玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上，冷却备用。
（2）试剂的配置
① CSB 缓冲液
42mmol/L柠檬酸钠(Sodum citrate)
0.83%(W/V)十二烷基肌氨酸钠(N- lauryl sarcosine)
0.2mmol/L巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(使用前加入)
（3）RNA 提取
对悬浮培养细胞A&1<、B&1<进行RNA提取，提取步骤如下：
① 50ml离心管中加入 10ml变性匀浆液，冰浴5分钟。
① 取0.5g细胞在液氮中研磨至粉末，转移至预冷的变性匀浆液中，加200ulβ巯基乙醇，振荡混匀。
② 迅速加入1ml 2mol/L乙酸钠(PH4.0)，充分混合。
③ 加入10ml水饱和酚，剧烈振荡 10~15秒，在冰上放置5分钟。
④ 加入2ml氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。
⑤ 4℃，12,000g，离心20分钟。
⑥ 小心移取上层水相，弃去中间相和下层有机相。
⑦ 加入6ml水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。
⑧ 加入6ml氯仿:异戊醇(24:1), 剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。
⑨ 4℃，12,000g，离心20分钟。
11小心移取上层水相。
12加入10ml异丙醇，放置-20℃至少30分钟沉淀RNA。
134℃，12,000g，离心15分钟收集RNA
1475%乙醇洗涤沉淀。
15加入200mlRNase-free水溶解RNA沉淀。
16溶解的 RNA-70℃保存。
（4）总RNA的检测
GeneQuantⅡ核酸定量分析仪测定、260nm、280nm的吸收值及二者的比值、 RNA的浓度、蛋白浓度等。
快速电泳RNA的完整性，电泳条件：0.7%琼脂糖胶，1×TAE，10~15V/cm。
2.2 反转录
在0.2ml离心管中加入下列试剂：
2mM Oligo(dG) 2ml
总RNA 3.060mg
2.5mMdNTP mix 4ml
Rnase-free H2O →12ml
混匀，65℃保温10分钟，立即置冰上，简单离心然后加入下列试剂：
5×First-Strand Buffer 4ml
0.1M DTT 2ml
40U/ml RNasin 1ml
轻弹混匀，42℃保温2分钟，加1ml SuperScriptⅡ反转录酶，混匀，然后42℃，温育50min; 70℃，15min以灭活反转录酶。
2.3 PCR扩增
20mlPCR反应体系中含如下试剂：
ddH2O 10.04ml
25mM MgCl2 1.20ml
10×PCR buffer 2.0ml
2.5mMdNTP 1.6ml
2mM Oligo(dG) 2ml
2mM随机引物 2ml
5U/mlTaq酶 0.16ml
摸板（cDNA第一链） 1ml
PCR扩增程序为：
95℃预变性5min；
30个PCR循环：95℃变性1 分钟，40℃退火2分钟，72℃延伸1.5分钟；
72℃延伸10分钟。
.2.4 DDRT-PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
（1） 配制以下储备液
A．40%丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺（Acr） 380g
N,N-亚甲双丙烯酰胺（Bis） 20g
双蒸水 →1000ml
过滤，4℃储存备用
B．10×TBE
Tris Base 216g
硼酸(Boric acid) 110g
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 74.5mL
双蒸水 →2000ml
C．10%过硫酸铵
过硫酸铵 1g
H2O 9g
-20℃保存。
D．0.5M EDTA
Na2-EDTA·2H2O 186.1g
双蒸水 →1000ml
用 NaOH调至pH8.0，灭菌。
E．上样缓冲液
8%去离子甲酰胺
10mM EDTA(pH8.0) 1ml
0.01%二甲苯青
0.01%溴酚蓝
（2） 6%序列胶配制
尿素 59g
40%Acr-Bis 18.0ml
10×TBE 12.0ml
10%AP 300ml
TEMED 30ml
甲酰胺 10ml
ddH2O →120ml
让其聚合至少2小时以上，1×TBE作为电泳缓冲液，预电泳30min，上样前冲洗上样孔。
（3） 玻璃板的清洁准备
用洗涤灵将玻璃板清洗干净，自然晾干或用吸水纸将水珠擦干，再用95%乙醇擦洗干净，自然晾干。
在平玻璃板上涂上 1.5ml0.2%Binding Silane（在1.5ml离心管中加入3uL Binding Silane和3uL冰醋酸，补足95%乙醇至 1.5ml），然后再用酒精擦干；耳朵板涂上2%的Repel Silane，再用95%酒精擦干，装配两块玻璃板。
（4） 6% 聚丙烯酰胺（PA）胶的制备
6%PA胶 50ml
10% 过硫酸胺 250ml（冬天）/150uL（夏天）
TEMED 50ml
摇匀后灌胶，将玻璃板30°角倾斜放置，从顶端一角缓慢灌入凝胶溶液，注意防止产生气泡，灌满后放平玻璃板，立即插入鲨鱼齿梳子，待胶凝固，聚合至少两小时以上。
（5） 上样、电泳
①在扩增产物中加入 uL 上样缓冲液，95℃变性8分钟后立即置冰上。
②将胶板安装在电泳槽内，准备电泳，电泳缓冲液为1×TBE
③将胶面沉积的尿素和气泡清洗干净，插入鲨鱼齿梳子。
④预电泳：恒定功率70W约30分钟左右。
⑤加入已变性的扩增产物 6uL，70W恒功率电泳约2.5小时。
⑥电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶将粘在平玻璃板上。
（6） 银染检测
①脱色与固定：电泳后将平板放入10%的冰醋酸中，胶面朝上，在水平摇床上脱色30分钟至指示剂无色。
②水洗：蒸馏水洗两次，各5分钟。
③银染：将平板放入银染液中（1g AgNO3 + 1.5mL 37% 甲醛 + 1LH20），于摇床上轻轻摇动30分钟。
④显影：用蒸馏水中冲洗一下（＜10秒＝立即放入预冷的显影液中（30g无水碳酸钠溶入1L水 + 1.5mL甲醛 + 200uL 10mg/mL硫代硫酸钠，置于4℃）直至DNA条带显出。
⑤定影：将胶板拿出放入10%的冰醋酸固定液，轻摇1-2分钟。
⑥冲洗：用蒸馏水冲洗1-2分钟。
⑦胶的干燥：室温下自然晾干。
⑧照像，保存图像。
差异cDNA片段的回收
用刀片将要回收的目标条带割下，小心移至0.5ml离心管中，加入20ml无菌水，100℃水浴煮15min，取出，冷却后保存于-20℃备用。
② 异硫氰酸胍变性匀浆液
异硫氰酸胍 (guanidine isothiocyanate) 25g
CSB缓冲液 33ml
混合，完全溶解后4℃保存备用。
③ 2mol/L乙酸钠 (PH4.0) 0.1%的DEPC处理
④ 75%乙醇 用RNase-free ddH2O 配制
