DDRT-PCR、AP-PCR与ARMS-PCR

2010-03-15 21:58 · Adam

1.DDRT-PCR(differential display reverse transcription PCR) 1992年,Liang等在AP-PCR和RT-PCR技术的基础上建立了mRNA差异显示(mRNA differential display,DD)或称差异显示反

1.DDRT-PCR(differential display reverse transcription PCR)

1992年,Liang等在AP-PCR和RT-PCR技术的基础上建立了mRNA差异显示(mRNA differential display,DD)或称差异显示反转录PCR(differential display reverse transcription PCR,DDRT- PCR),是一种有效的筛选差异表达基因的方法。Liang等开始建立此技术时,设计的3’端引物T12MN(M为A、C或G;N为A、G或T)即3,端有12条引物,而5’端有20条随机引物,每条引物由l0bp组成,通过计算机随机分析表明:

这种组合从统计学上讲差异表达的基因可i00%地被筛选表达出来。但操作时非特异性带较多,假阳性较高,后续步骤较麻烦。因此人们对3’端引物和PCR参数等都进行了改进,以降低假阳性获得最佳效果。

2.AP-PCR(arbitrarily primed PCR)

AP-PCR技术是在对所扩增的基因序列一无所知的情况下随意设计或选择一个非特异性引物,在PCR反应体系中,首先使引物与模板DNA中许多序列通过错配而复性。在理论上并不一定要求整个引物都与模板复性,而只要引物的一部分特别是3’端有3~4bp与模板互补复性即可使引物延伸。如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物存在,则可经TaqDNA聚合酶的作用使引物延伸而发生DNA片段的扩增,经1至数轮不严格条件下的PCR循环后,再于严格条件下进行扩增。扩增的产物经DNA测序凝胶电泳分离后,经过放射自显影或荧光显示即可得到DNA指纹图,通过对不同来源基因指纹图的比较,即可反映出待分析基因组的特征。

3.ARMS-PCR(amplification refractory mutation system)

扩增耐突变系统,又名等位基因特异PCR(allele specific PCR,ASPCR),它的基本原理是,TaqDNA聚合酶缺少3’+5’外切酶活性;在一定条件下PCR引物3’末端的错配导致产物的急剧减少,针对不同的已知突变,设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。这种方法最首要的一步就是根据已知的突变设计合适的引物,其次就是PCR循环条件的优化,最后通过电泳观察即可判读结果。

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