张汉尧1 何川生2 郑成木1
(1 中国烟草育种研究南方中心 云南玉溪 653100)
(2 华南热带农业大学农学院 海南儋州 571737)
摘 要 通过传统方法的对比、改进，寻找一条快速、简易的适于烟草RAPD分析用的DNA提取方法。分析不同的DNA提取方法及不同的材料状态对RAPD分析的影响。
关键词 烟草 提取 DNA RAPD 影响
随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，简称RAPD）是Williams等1990年提出的一种分子标记技术。其原理是运用PCR，利用一系列不同的寡聚核苷酸单链为引物，扩增总 DNA中的一些片段。由于其具有快速有效、灵敏度高、无放射性污染、实验步骤简化、操作安全、成本低、速度快、结果易于传递等优点，是近年来发展得最快的一种分子标记技术。目前已在苜蓿、豆类、番茄、辽东栋、蔗糖、丁香、葡萄、番木瓜、棉花、月季、牡丹、锦鸡儿、野大豆、桉树、玉米、水稻等多种植物中广泛应有。然而有关烟草RAPD分析却少见报道。因为烟草中蛋白质、糖类、色素、烟碱及酚类等物质含量较高，给DNA的分离和纯化工作带来了干扰和困难。而高分子组成基因组DNA的成功制备是RAPD成功的关键。
目前，有关提取植物DNA的方法很多，由于植物种类繁多，其中某些植物有其特殊性，故尚无统一的方法。如果仅用一般分离、纯化植物DNA的方法来处理烟草这类材料，其结果往往不令人满意。为此，我们把传统的SDS、EDTA法进行比较，并改变其中的一些步骤和药品，试图找出一种简单易行适合RAPD分析用的烟草总DNA提取方法。
1 材料与方法
1.1 供试材料
烤烟品种4份，均由中国烟草育种研究南方中心提供。
| 编号 | 代表材料名称 | 样品状况 | 产地 |
| 1 | K326 | Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ | 美国 |
| 2 | 红花大金元 | Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ | 中国云南 |
| 3 | 云烟317 | Ⅰ，Ⅱ | 中国云南 |
| 4 | NCTG55 | Ⅰ，Ⅱ | 美国 |
注：Ⅰ为干叶；Ⅱ为鲜叶；Ⅲ为种子发出的幼苗；Ⅳ为组培苗的鲜叶
1.2 实验方法
1.2.1 传统的SDS法和CTAB法
本实验中SDS法和CTAB法所用的药品与程序与顾红雅等的方法相同。
1.2.2 改良的CTAB法
试剂2×CTAB，100mmol/L Tris,20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaC1,2%PVP，5M KAc,异丙醇，Cl（氯仿：异戊醇=24：1），70%乙醇，0.1×TE。
提取DNA流程：①取样品0.05g，加入2%的PVP，将样品在研钵中磨碎，转入1.5ml的离心管中；②加入1m12×CTAB，在65℃的水浴锅中保温60分钟；③加入300μl 5M醋酸钾冰浴静置30分钟；④在℃下12000rpm离心15分钟，上清液转入新管；⑤加入2/3体积Cl（氯仿：异戊醇=24：1），缓慢摇动15分钟；⑥室温下10000rpm离心10分钟；⑦上清液转入新管中加2/3体积的异丙醇，混合后于室温静置30分钟；⑧将絮状DNA挑出；⑨用70%乙醇洗 2次，风干；⑩加0.1×TE溶解备用。
1.2.3 RAPD扩增与检测
试剂与仪器 dVTPs购自MBI公司，Taq酶也是MBI公司的产品。随机引物为加拿大Sangon公司生产的十聚体核苷酸。PCR仪为Geneamp PCR(Perkin Elmer)。
PCR反应体系 体积为20μl，其中包括10mM Tris-Hcl,pH9.0,50mM KC1,0.1% Triton X-100,4.0mM MgC12,3mM dNTPs,0.5μM引物,0.8U Taq 酶(MBI)4μL模板DNA。
反应程序 先在94℃下变性6分钟，然后进行40个循环（每个循环包括94℃下变性30秒、34℃下退火30秒、72℃下延伸90秒），最后在72℃下继续延伸6分钟。
检测方法 扩增产物加2μL的上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚蓝），在1.0%的琼脂糖凝胶（5V/cm)中电泳，0.5μg/ml溴化乙锭中染色，在紫外灯下观测结果，并用polaroid 667型照相机照相。
2 结果与分析 2.1 传统的CTAB法和SDS法和改良的CTAB法提取DNA的效果及其RAPD扩增结果比较 几个烤烟品种利用传统CTAB法和SDS法均可提取出 DNA（经电泳可检测出），但提取出的DNA颜色为棕褐色或棕黄色。以这两种方法提取的总DNA为模板，进行RAPD扩增，不能得到清晰的条带（如图1中的1、2和4、5），该结果表明，传统的CTAB法和SDS法提取出的DNA难以用于RAPD扩增所需模板DNA的提取。其原因可能是提取的DNA纯度不够，含较多量的多糖和酚类物质，这些糖类物质和氧化后的酚类物质与DNA共价结合，使DNA带棕色或褐色，在反应体系中抑制了Taq酶的活性从从而抑制了 DNA特殊片段的扩增反应。而改良了的CTAB法提取出的DNA纯度较高，用于RAPD分析，可得到较好的扩增结果。
2.2 用改良CTAB法提取不同状态材料的DNA效果及其RAPD扩增结果。
用改良的CTAB法从干样品、鲜样品、组培苗和以种子发芽的幼苗中提取的DNA模板，皆为无色或浅黄色，电泳检测效果完全相同。图3中引物S420和S383对4种材料状态提取出的DNA样品的扩增效果都很好，而且带型基本一致。虽然这4个样品采自同一品种的不同个体，但因烤烟是自花授粉植物，各个体间的遗传变异小，故同一引物的扩增产物基本一致。此结果说明从不同的材料状态中提取的DNA可以获得同等的扩增效果。
2.3 PVP对DNA提取效果和RAPD扩增结果的影响
本实验在DNA提取液中加入PVP抗氧化剂，以防止DNA提取过程中多酚类物质氧化抑制RAPD扩增反应。从提取DNA的电泳结果看，是否加入抗氧化剂似乎与DNA的提取出的量无关，但在DNA的提取过程中加入抗氧化剂PVP处理，其抽提液及DNA的颜色都明显变浅，对于颜色较深或组合较老的材料，其作用更为明显。而烤烟不同品种材料和同一品种样品的不同状况对抗氧化剂的反应也有一定的差异，主要表现在DNA提取过程中颜色的深浅变化。从 RAPD结果看，有否加抗氧化剂的产物有明显差异，图4中加入PVP的处理，扩增产物明显多于不加氧化剂的处理，表现为强带变弱和弱带变无。可见PVP是烟草DNA提取的较好的抗氧化剂，可成功地防止酚类物质的氧化而干扰RAPD反应结果。
2.4 Cl抽提对DNA提取效果和RAPD扩增结果的影响
我们设置了不经Cl抽提，Cl抽提1次，Cl抽提2次，Cl抽提3次的对比实验，3个不同品种重复2次。从DNA提取的效果来看，DNA提取出的量经纯化次数地增多而逐渐减少，CNA的颜色也由深而逐渐变浅从RAPD结果来看，Cl的抽提次数对扩增反应没有影响，但不经Cl抽提的DNA扩增效果不良。如图5所示4与2相比，前者含蛋白质（不经Cl抽提），后者的蛋白质已被除去（经Cl抽提2次），其它扩增条件一致，扩增产物不相同，说明模板中含过量的蛋白质会影响扩增。2与3相比，虽然Cl抽提次数不同（分别为2、1次），但扩增效果相同，说明一定量的蛋白质存在对扩增效果没有影响。152,3 相比扩增出的条带相对较弱，说明抽提次数多了，会影响提取出的DNA的量，进而会影响扩增效果。
3 结论
烟草植物组织中含有大量的特殊内含物质（如多糖、多酚类和色素等），氧化后易与DNA共价结合，是干扰和影响RAPD反应的主要成分。本实验通过传统的CTAB法和SDS的对比，着重对抗氧化剂（PVP）、Cl提纯等因素进行研究，找到了一条适于RAPD分析的烤烟DNA提取方法。
在DNA提取过程中为防止酚类物质的氧化，通常在提取液中加入一定量的抗氧化剂，如在苹果中加入巯基乙醇（杜国强等，1999），在梨DNA提取液中加入一定量的Vc（胡春根等，1998），在荔枝中加入Na2S205(易干军等，1999）。而本实验中PVP更适于烟草DNA提取，可见不同种类的DNA提取，需要的抗氧化剂不一定相同。
实验结果表明：不论是CTAB法还是SDS法，均可提出DNA，但提取出的DNA杂质含量太大；而改良的CTAB法则可以提取出适于RAPD分析用的质量好、纯度高的DNA。用改良CTAB法，不同状况的样品提取出DNA质量一样，扩增效果一样。利用PVP为抗氧化剂，可有效地除去多酚类物质。模板DNA中含有一定量的蛋白质不影响烟草的RAPD扩增反应结果，但过量时则会影响扩增效果；Cl抽提次数过多会影响DNA提取的量，对扩增效果也会造成影响。
