RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA),意为随机扩增多态性DNA,是利用PCR技术进行随机扩增,把扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳,根据DNA条带的多态性来反应模板DNA序列上的多态性。RAPD同AFLP、SSR等分子标记一样都基于PCR扩增,只是RAPD分析只需要一个引物,其引物长度一般为10个核甘酸,其序列是随机的,不同核甘酸序列的引物均有商品出售。
单引物扩增是通过一个引物在两条DNA互补链上的随机配对来完成。由于基因组DNA的差异,使引物与模板的结合位点及这些位点之间的距离不同,使PCR扩增后的片段大小表现出多态性。在基因组DNA分子内可能存在或长或短被间隔开的颠倒重复序列,如果这些序列与引物能碱基配对,则在两条单链上就会出现该引物的结合位点,结合位点的数量取决于这种重复序列的多少。不同DNA分子中这种颠倒重复序列间隔的长短不同,扩增条带的大小就不同,即表现出多态性。
10碱基引物理论上有 410 种组合,不同引物检测的模板序列不同,用足够多的引物可覆盖基因组全序列,检测位点多,可以在完全不知道分子生物学背景的情况下对基因组进行分析,是研究植物系谱关系、起源与进化、遗传多样性及分子标记辅助育种的简单易行的方法;此外,外源基因转化后,转基因植株与非转基因植株相比,外源基因插入的部位导致基因组DNA序列不同或重排,当引物适宜时,扩增条带的长短就会不同,RAPD技术可以检测出对照植株和转化植株PCR产物带型的区别。
由于随机引物短,与模板结合的退火温度低,易出现碱基错配,因此在实验中要严格操作程序及条件,使RAPD分析的结果较为稳定。因其费用较低,方便易行,模板DNA用量少,不需要同位素,安全性好,继RFLP之后得到广泛应用;且操作上比AFLP、SSR等分子标记较为简便易行,因此,多数种类的栽培植物在资源多样性、分子标记等方面都有大量RAPD的研究报道。
本实验目的是学习RAPD技术的原理,掌握RAPD的操作及分析方法。
一、试材及用具
试材:植物基因组DNA。
用具:PCR仪,1μL、10μL、20μL、100μL微量移液器及吸管,PCR管(200μL或500μL)及管架,1.5 mL离心管及管架,离心机,记号笔,磁力搅拌器,高压灭菌锅,电泳仪,电泳槽,电炉,三角瓶,紫外透射仪、凝胶成像系统。
药品:10 核苷随机引物、dNTP、琼脂糖、耐热DNA聚合酶[TagDNA聚合酶,与酶一起的还有两种药品,分别是10× PCR Buffer(500 mmol/LKCL、pH 9.0的100 mmol/L Tris-Cl、1.0%Tritonx