【实验原理】
扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphisms,Amp-FLP）根据PCR技术原理，针对靶基因座的侧翼序列设计一对特异性引物，采用适当的PCR 反应体系和热循环条件，可扩增出该基因座等位基因。PCR 产物经电泳分离、显带后，杂合子为两条长度不等的片段，纯合子为一条片段。根据片段长度判定等位基因和基因型。
vWF III 位点是以TCTA 四个核苷酸为重复单位的短串联重复位点，位于vWF 基因第40内含子中。
【实验仪器】
Ependoff 管、微量加样器、台式离心机、PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽
易生物仪器库：https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
【实验试剂】
1.引物（10umol/L） 2.Taq DNA 聚合酶（0.5U/ul）
3.10× buffer 4.dNTP（每种25mM）
5.无菌去离子水 6.液体石蜡
7.聚丙烯酰胺母液(T＝30％，C＝5％) 8.TEMED（四甲基乙二胺）
9.PAS（10％过硫酸铵） 10.TBE（1X, 5X）
11.尿素
12.上样缓冲液—0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，98％甲酰胺
13.固定液—10％冰醋酸
14.染色液—2g AgNO3，3ml 37％甲醛溶于2L 水中
15.显色液—60g Na2CO3，3ml 37％甲醛，400ul 12％硫代硫酸钠溶于2L 水中
【实验方法】
一、 PCR 扩增
1 PCR 扩增体系：无菌去离子水 8.5ul
10X Buffer 2ul
引物1 2ul
引物2 2ul
dNTP 1.5ul
Taq 酶 2ul
DNA 模板 2ul
总体系20ul(最后加模板)，其中含有1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris
•HCl（pH8.4），dNTP 各187.5umol/L，Taq DNA 聚合酶1U，引物各1.0umol/L，模板DNA 50～100ng。
2.PCR 扩增条件：94℃预变性35sec；94℃变性45sec，58℃退火和延伸4min，30 次循环后于72℃继续保温8min。
二、 PCR 扩增产物的检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染：
凝胶制备: 聚丙烯酰胺母液(T=30%, C=5%) 4ml
5X TBE 4ml
尿 素 8.4g
加水至20ml, 配成终浓度T=30%, C=5%的工作液。在工作液中加入200ul PAS 和20ul TEMED 充分混匀后迅速灌入凝胶模，水平放置30min 凝集后即制成聚丙烯酰胺凝胶。
电泳：将凝胶板置于电泳仪上，电极缓冲液为1X TBE，将加有1／5 体积上样缓冲液的PCR 扩增产物上样电泳，10W 电泳1h 左右停止电泳。
显谱： 200ml 固定液中固定30min。
蒸馏水洗3 次，每次3min。
200ml 染色液中染色30min。
蒸馏水快速冲洗凝胶一遍（20s 以内）。
加入200ml 显色液，5min 左右显色。
加入10％冰醋酸终止显色，水洗后凝胶干燥保存。
三、结果判读与分析
根据片段长度判定等位基因和基因型。杂合子为两条长度不等的片段，纯合子为一条片段。
