一、实验原理
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。
PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的 3 ′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。 现用图示说明PCR原理:
二、仪器及试剂
1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等
2.试剂：
10X PCR 缓冲液配制（部分随Taq酶提供）：
250～500 mmol/L KCl
100～500 mmol/L Tris-Cl（pH8.4）
15～20 mmol/L MgCl2
0.5% Tween-20
1mg/L BSA
其它试剂：模板DNA、dNTP 混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖凝胶、等
三、操作步骤
1. PCR 体系（40ul）：
4ul 10XPCR 缓冲液
4ul 25mM MgCl2（根据不同公司PCR 缓冲液的不同而定）
Xul 模板DNA ≥50ng
1ul 上游引物（50-100ng）
1ul 下游引物（50-100ng）
1ul dNTP Mixture（终浓度20－200uM）
0.4 ul Taq聚合酶
加ddH2O至40ul
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置：
（1） 95℃ 300s 变性
（2） 94℃ 45s 变性
（3） 55℃ 45s 退火（根据不同引物可能有不同退火温度）
（4） 72℃ 45s 延伸（每分钟可延伸1kp）
重复步骤2-4共 30 循环
（5） 72℃ 600s 延伸
反应结束后短暂离心，吸取少量（10ul）进行分析，其余置
4℃保存备用。
4. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
四、 注意事项：
1. PCR 体系所加成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。
2.加样时要认真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。
3.Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。
五 、影响PCR的主要因素
1.模板DNA
单链、双链DNA均可作为PCR的模板，DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。模板用量依具体实验而定，一般为100ul反应液有105-106个目标分子。PCR反应时模板变性要充分。
2. PCR引物
PCR引物设计是否成功是能否获得高质量PCR产物最关键的因素之一。在设计和应用时，需注意以下重要环节：
（1）PCR引物的长度约为18～30个核苷酸，并且成对引物间的G＋C含量应相似。以使它们在相近的温度下与其互补序列结合。G+C含量应为45%～55%之间。碱基分布是随机的，应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3，端出现3个连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。引物3，端碱基最好选用A、G、C,尽可能地避免选用T ,尤其应避免连续出现2个以上T。
（2）一般来说，PCR产物≤500bp时，引物长度选择16-18bp；PCR产物≥5kb时，引物长度选择24bp左右为宜。
（3）要避免引物分子自身序列互补，否则会形成发夹样二级结构。两个PCR引物相互之间的3，末端序列不能有明显的互补性，以免形成引物二聚体。
（4）引物的熔点温度（Tm值）要适当。Tm值与引物的碱基组成和长度有关；PCR引物的GC/AT应与要扩增的模板DNA相当或略高些。一般熔点温度以大于55℃为宜。
（5）引物的3，末端必须与模板严格互补，而5，末端的要求可灵活些。
（6）目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。
（7）用于亚克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性内切酶位点。为了保证内切酶有效酶切扩增产物，一般在酶切位点的5，端再加上几个额外的碱基。
（8）引物的浓度，在终浓度为0.2～1.0 umol/L的范围内产量基本相同，低于0.2 umol/L时会影响产量。但过高时一乃不经济，二则会出现非特异扩增及增加引物二聚体的产生。
3. 热稳定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）
一般用量为2.5 U/100uL 反应体积。酶量过多易导致非特异性产物的产生。该类酶的最适温度为75℃，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物-模板的非特异延伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。
4. dNTPs
PCR常用的dNTP浓度在50-200umol/L。四种dNTPs应等当量。浓度
低则反应速度下降，过高则特异性下降，可根据具体实验来确定最适的dNTP浓度。
5. PCR缓冲液
因PCR反应中的dNTP能与Mg2+结合，影响反应液中游离Mg2+的浓度，所以应按不同条件，确定合适的Mg2+浓度。一般在标准的PCR反应中（dNTP浓度200umol/L），Mg2+浓度约为1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响PCR的产量及产物特异性。浓度高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%～0.1%)及5mmol的二硫苏糖醇（DTT）对酶有一定的保护作用。
6. PCR循环的温度
预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一般为94℃ 3-5min。变性不完全时，DNA双链会很快复性，影响PCR反应，但若变性温度太高（不宜超过95℃），会影响Taq酶的活性。
变性：一般为94℃ 30s或95℃ 20s。
引物退火：应根据具体反应中引物与模板的碱基配对情况及实验的目的确定。一般为50-72℃。退火温度增高会增强对不正确退火引物的识别，还能降低引物3，端不正确核苷酸的错误延伸。
延伸：一般为72℃ 60-90s。最后一个循环后应在72℃保留5min，以保证PCR产物合成的完整性。
7．平台效应和PCR循环的次数
在PCR基因扩增的后期，由于产物的堆积，将使原来产物以指数增加的速度变为平坦曲线，即所谓平台效应。它的出现是由于PCR原料的不断消耗、酶的稳定性的降低、终产物的阻滞效应及非特异性产物等多种因素造成的，所以选择合理的循环次数，既能得到足够量的PCR产物，又不要无意义地增加循环次数。
8. 操作环境
避免环境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目标DNA的污染等。
