张驰宇1 ,2) , 张高红1 ,2) , 杨 敏1) , 贲昆龙1) 3
(1) 中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室,昆明 650223 ;2) 中国科学院研究生院,北京 100039)
摘要 为建立一种新的 SYBR green Ⅰ实时定量RT-PCR 方法,使之能够有效消除引物二聚体(PDs)对实时定量结果的影响. 对RT-PCR 特异性扩增产物和PDs 分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析. 依据PDs 和扩增产物的熔解温度( Tm) 特点,在通用的三步法的延伸步骤之后,增加一个短暂的(5 s) 恒温和荧光检测步骤,使这个步骤的温度高于PDs 的Tm ,但低于扩增产物的Tm ,简称该法为四步法. PDs 的Tm 通常高于72 ℃,但低于扩增产物的Tm . 将四步法第四步的温度设置在高于PDs 的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时,四步法能够有效地消除PDs 的影响. 对三步法和四步法SYBR green Ⅰ实时定量RT-PCR 进行了比较,发现三步法根本不能用于RNA 的实时定量,而四步法能够实现包括低丰度RNA 在内的RNA 的定量. 选择Tm 值尽可能小的引物,使PDs 与扩增产物Tm 值之间有足够的差距,将更有利于四步法的应用,并可成功地用于低丰度RNA 的准确定量.
关键词 引物二聚体,荧光实时定量RT-PCR ,SYBR green Ⅰ,四步法,RNA 定量
Elimination of Primer2dimer Effect in SYBR Green Ⅰ Real-time
RT-PCR Using 42step Program
ZHANG Chi2yu1) , 2) , ZHANG Gao2hong1 , 2) , YANGMin1) , BEN Kun2long1) 3
(1) Laboratory for Molecular and Cell Immunology , Kunming Institute of Zoology , The Chinese Academy of Sciences , Kunming 650223 , China ;
2) The Graduate School of Chinese Academy of Sciences , Beijing 100039 , China)
Abstract To develop a new method for effectively eliminating the effect of primer2dimers ( PDs) in SYBR green Ⅰ real2time RT-PCR the specific amplicons and PDs formed by RT-PCR were measured by gel
electrophoresis with ethidium bromide staining ,and the characteristic of their melting temperatures( Tm) were analysed by melting curves. The so2called 42step program in SYBR green Ⅰreal2time RT-PCR was developed by adding a 5 s holding at the optimal temperature between Tm of PDs and amplicons for reading fluorescence signal after extension step of RT-PCR , and was compared with 32step programs on quantification of low abundance RNA. The 42step program effectively eliminated the artifact of PDs in SYBR green Ⅰreal2time RT-PCR. In addition , the 42step program may be used for quantifying low abundance RNA ,while the 32step program may not . The primer pair with low Tm should be preferably selected for the efficient elimination of the effect of PDs on quantification of low abundance RNA.
在生物学的许多研究领域需要进行基因表达的定量分析. 近些年来发展起来的荧光实时定量RT2 PCR 技术克服了通用RT2PCR 定量的许多不足之处,使准确定量RNA 成为现实[1 , 2 ] . 荧光实时定量 RT2PCR 中,当使用荧光探针时,能检测PCR 中的特异性扩增产物,而不受非特异性扩增产物的影响,因此被广泛应用于mRNA 和以RNA 为基因组的病原体的定量[2 , 3 ] . 一条有效的荧光探针需要具备很高的保守性、合适的GC 含量和长度、以及合适的熔解温度(melting temperature , Tm) 等,这使探针设计的难度大大增加. 另外,探针合成的价格比较昂贵,并且还需要针对不同的基因来设计不同的探针,因而在一定程度上限制了特异性荧光探针的使用[1 ] . 与荧光探针不同,SYBR green Ⅰ是一种双链DNA 结合染料,能特异性地结合到DNA 双链的小沟中. 游离的 SYBR green Ⅰ基本没有荧光信号,但结合双链DNA 后,它的荧光信号可成百倍的增加. 在RT2PCR 过程中,随着PCR 循环数的增多,特异性PCR 产物的量增加,结合到双链DNA 上的SYBR green Ⅰ增加,荧光信号也相应增加. 通过特定的相机对PCR 过程中每一个循环的荧光信号进行实时检测,即可实现对目的基因的实时定量.
用SYBR green Ⅰ进行实时定量RT2PCR 时,只要有合适的引物和模板,即可实现任何目的基因的实时定量. 此外,SYBR green Ⅰ的价格比较便宜,所以 SYBR green Ⅰ实时定量RT2PCR 是十分值得推荐的荧光实时定量RT2PCR 技术[1 ] . 但是,SYBR green Ⅰ 对双链DNA 的结合是非特异性的,RT2PCR 中的非特异性扩增产物,特别是引物二聚体(primer2dimers , PDs) ,也会产生荧光信号并严重干扰对目的基因的定量[4 , 5 ] . 通常的PCR 反应采用三步法,包括变性、复性和延伸三步. 进行实时定量反应时,定量PCR 仪生产者通常推荐采用二步法,二步法将复性和延伸合并为一个步骤,这样有利于采用荧光探针方法进行的实时定量反应. 但是,当采用二步法和三步法进行SYBR green Ⅰ实时定量反应时, PDs 的影响将无法避免. 因此,我们介绍一种新的方法———四步法 SYBR green Ⅰ实时定量RT2PCR(简称四步法) ,它能够很好地消除引物二聚体对实时定量RT2PCR 的影响.
