PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)
问题1：无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无
原因:
1. 模板:含有抑制物，含量低
2.Buffer对样品不合适
3.引物设计不当或者发生降解
4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对策:
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更换Buffer或调整浓度
3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4.降低退火温度、延长延伸时间
问题2：非特异性扩增
现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
原因：
1.引物特异性差
2.模板或引物浓度过高
3.酶量过多
4.Mg2+浓度偏高
5.退火温度偏低
6.循环次数过多
对策：
1.重新设计引物或者使用巢式PCR
2.适当降低模板或引物浓度
3.适当减少酶量
4.降低镁离子浓度
5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6.减少循环次数>>
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问题3：拖尾
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现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：
1.模板不纯
2.Buffer不合适
3.退火温度偏低
4.酶量过多
5.dNTP、Mg 2+浓度偏高
6.循环次数过多
对策：
1.纯化模板
2.更换Buffer
3.适当提高退火温度
4.适量用酶
5.适当降低dNTP和镁离子的浓度
6.减少循环次数
问题4：假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原因：
靶序列或扩增产物
的交*污染
对策：
1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管>
及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存>>
现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
原因：
1.引物特异性差
2. 模板或引物浓度过高
3.酶量过多
4.Mg2+浓度偏高
5.退火温度偏低
6.循环次数过多
对策：
1. 重新设计引物或者使用巢式PCR
2.适当降低模板或引物浓度
3.适当减少酶量
4.降低镁离子浓度
5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6.减少循环次数
问题3：拖尾
现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：
1.模板不纯
2.Buffer 不合适
3.退火温度偏低
4.酶量过多
5.dNTP、Mg 2+浓度偏高
6.循环次数过多
对策：
1.纯化模板
2.更换Buffer
3.适当提高退火温度
4.适量用酶
5.适当降低 dNTP和镁离子的浓度
6.减少循环次数
问题4：假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原因：
靶序列或扩增产物
的交*污染
对策：
1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管
及加样枪头等均应一次性使用。
3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存
