任亮，朱宝芹，张轶博，王海燕，李尘远，苏玉虹，巴彩凤
(锦州医学院辽宁省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室，辽宁锦州 121001)
【摘要】目的运用Primer Premier 5．0软件设计PCR引物，并且检验所设计引物的PCR扩增效率和特异性。方法运用Primer Premier 5．0软件设计l6对猪和犬的PCR扩增引物，通过PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验结果。结果在所设计的l6对引物中有8对PCR扩增特异性好且效率高，成功率50％。但是，其中早期设计引物l2对只有4对成功，后期设计引物4对全部成功。结论从引物设计的过程中可以看到一种趋势一后期引物设计的成功率远远高于早期。这表明我们在引物设计方面正在逐步成熟，特别是运用比较基因组学定位的原理在分离新基因的引物设计方面积累了较多的经验。
【关键词】PCR引物设计；软件PrimerPremier 5．0；PCR
The Research of Applying Primer Premier 5．0 to Design PCR Primer
REN Liang，ZHU Bao—qin，ZHANG Yi—bo ，W ANG Hai—yan，
LI Chen—yuan，SU Yu—hong，BA Cai—feng
(Key Laboratory of Molecular Cell Biology and New Drug of
Liaoning Province，Jinzhou Medical College，Jinzhou 121001 China)
【Abstract】Objective With the help of Primer Premier 5．0 to design PCR primer and verifying the efficiency and speciality of PCR about these primers．Methods Sixteen pairs of primers that would be amplified in Genomics of pig and dog were designed by Primer Premier 5．0．The results of PCR would be investigated through agarose gel electrophoresis．Results Eight pairs of primers in all designed SUE ceeded in the efficiency and speciality of PCR，the ratio of SUCCESS WaS 50 percent．The twelye pairs of primers what were designed in the forepart of the experiment were only four to amplify better．How． ever，the four pairs of primers design ed in the anaphase all succeeded ．Conclusions There is a trend that earl be recognized in the process of designing primer．Nam ely，the forepart is far more than the anaphase in the ratio of SUCCESS to design primer．It is indicated that our technology to design primer is further professiona1．Moreover，the most importan t is that the technique route of using the compara—tive genomics to isolate new gene is farther comprehended and perfected and placing a direction at next expe riment．
【Key words】design primer；Primer Premier 5．0；PCR
自从1985年美国PE—Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction；PCR)以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。然而找到一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地扩增模板DNA序列，无疑决定着PCR的成败。Primer Premier 5．0作为当今引物设计的主流软件，有着操作简便、功能强大、成功率高等诸多优点。本文结合多位研究者的实验结果对运用Primer Premier 5．0软件设计引物的经验和教训进行探讨。
1 材料和方法
1．1 实验材料及软件
实验用通城纯种猪基因组DNA 由华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室提供。实验用比格犬基因组DNA由军事医学科学院动物实验中心提供。PCR引物设计软件Primer Premier 5．0可以在www.bbioo.com/soft/下载。
1．2 PCR引物的设计
1．2．1 模板的选择 进行引物设计时模板选择有两种情况。一是扩增已知基因，这时需要在GeneBank数据库中搜索相同物种该基因的DNA或者mRNA为模板来设计引物。另一种是扩增未知基因，这时根据比较基因组定位的原理，选择研究深入的人或哺乳动物(如小鼠)保守的功能基因的DNA或者mRNA序列为模板来设计引物。
1．2．2 运用Primer Premier 5．0进行引物设计综合考虑引物设计的各项原则，用Primer Premier 5．0软件设计16对引物，引物序列见表1。
表1 引物的详细信息
注：1．模板名称中的x、Y和Z为特定功能基因的代表符号。
2．表中4和6的产物实际长度大于预期长度是因为以mRNA为模板设计的引物，在以基因组DNA为模板扩增时， 目的片段间插入了内含子。
1.3PCR扩增
按照退火温度将PCR反应分为4组，1组退火温度为52"C，包括2、3、5、7、8 9和10号；2组退火温度为55℃ ，包括1、4、6和】4号；3组退火温度为56℃ ，包括l2、l5和l6号；4 组逼火温度为57℃ ，包括11和13号。PCR 反应体系：基因组DNA 100ng， 引物20pmol/l ，d FP10mmol/L．MgCI2 1.5ram01/“1．TaqDNA 聚合酶IU，加灭菌双蒸水至总体积20ul。PCR扩增条件：94t：预变性3rain：94℃ 变性lmin，退火温度见表l时问lmin，72℃ 延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10minl‘～ 。
1.4 琼脂糖凝胶电泳检测
从每个扩增管中取出1．5tA H 扩增产物加人3ul上样缓冲液混匀，点样于1％琼脂糖凝胶上，同时在点样孔中加100bpMarker或者200bpMarker作为分子量参照。5V、 cm电泳60min。电泳结束后，在紫外灯下观察扩增结
果并拍照。
2.结果
2．1 电泳结果
l组的2、3、5、9、10号和2组的l、4、6号PCR扩增效率高、特异性好、电泳结果呈单一亮带，引物设计成功.其余各引物无特异性条带或者无条带被检测到，引物设计失败(详见表1)。把PCR扩增成功的引物重复检测一次，照相结果如图l和图2。
2．2 结果分析
在设计的16对引物中有8对扩增成功，总体成功率50％。但是，上述16对引物是先后两个时期设计完成的。先期我们设计了 l2对引物，其中扩增已知基因的3对引物是l、2和3号，全部扩增成功；扩增未知基因的9对引物是6、7、8、ll、l2、l3、l4、15和l6号，只有6号扩增成功。后期我们设计。了4对引物．其中扩增已知基因的2对引物是4和5号……
