核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定DNA在凝胶中的位置。
一、影响核酸电泳的因素
1、核酸的性质
核酸的电荷量，分子大小，分子的空间构象等决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。对于线状双链DNA分子，在凝胶电泳中，分子量的常用对数与泳动率成反比关系，一般双链DNA基本上不存在影响迁移率的复杂构象，但分子的空间构象也影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA 迁移速率则是：闭环型<线性<单链开环型。
对于单链RNA或DNA，其在凝胶电泳中的迁移率受碱基组织和序列的影响，同等大小的核酸可能由于空间构象不同而使迁移率不同，故可利用变性凝胶电泳分离纯化单链核酸。
2、凝胶孔径的大小：
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段，琼脂糖凝胶的孔径大，分辨率低，但分离范围广，约100bp~50kb的DNA；PAG的孔径小，分离小片段（5~500bp）DNA效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。凝胶孔径的大小是影响核酸在凝胶电泳中迁移率的最基本因素，它决定了能被分离的片段的大小。下表列出不同凝胶浓度与其分离DNA分子大小的范围。
凝胶
胶浓度（%）
线状DNA分子的有效分离范围
溴酚兰*
琼脂糖
0.3
5~60 (kb)
0.7
0.8~10
0.9
0.5~7
1.2
0.4~6
1.5
0.2~4
2.0
0.1~3
PAG
3.5
100~2000 (bp)
100
5.0
80~500
65
8.0
60~400
45
12.0
40~200
20
15.0
25~150
15
20.0
6~100
12
*指迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）
3、电场强度和电场方向：
低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。随电场强度增加，高分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增加，使凝胶的有效分离范围缩小。对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨力和整齐的带型。如果电场呈周期性变化，各种分子量的DNA片段为适应新的电场变化所需的时间将不同，分子量越大，则所需的时间越多。因此可以通过脉冲电场凝胶电泳分离极大片段的DNA。
4、电泳环境
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。Tris-Cl缓冲体系中，由于Cl－的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常采用含EDTA的Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）和Tris-磷酸（TPE）三种缓冲体系。传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。TBE与TPE有较高的缓冲能力，现多用，但因TBE中硼酸易与琼脂糖形成复合物，在短时间（≤5h）琼脂糖凝胶电泳时，常用TAE，而在PAGE中常用TBE。双链线状DNA在TAE中迁移速率比TBE或TPE中快将近10%，但各个缓冲体系的分辨能力几乎相同，（对超螺旋DNA，在TAE 中的分辨率比在TBE中的更好）。凝胶电泳后要回收DNA片段，不宜采用TPE缓冲体系，这使DNA片段含较高的磷酸盐、易与DNA一起沉淀，而影响一些酶反应，缓冲液中含EDTA，目的在于螯合二价离子，抑制核酸酶以保护核酸。
缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。
缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带负电荷，向正极泳动。
在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。
核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定DNA在凝胶中的位置。
一、影响核酸电泳的因素
1、核酸的性质
核酸的电荷量，分子大小，分子的空间构象等决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。对于线状双链DNA分子，在凝胶电泳中，分子量的常用对数与泳动率成反比关系，一般双链DNA基本上不存在影响迁移率的复杂构象，但分子的空间构象也影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA 迁移速率则是：闭环型<线性<单链开环型。
对于单链RNA或DNA，其在凝胶电泳中的迁移率受碱基组织和序列的影响，同等大小的核酸可能由于空间构象不同而使迁移率不同，故可利用变性凝胶电泳分离纯化单链核酸。
2、凝胶孔径的大小：
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段，琼脂糖凝胶的孔径大，分辨率低，但分离范围广，约100bp~50kb的DNA；PAG的孔径小，分离小片段（5~500bp）DNA效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。凝胶孔径的大小是影响核酸在凝胶电泳中迁移率的最基本因素，它决定了能被分离的片段的大小。下表列出不同凝胶浓度与其分离DNA分子大小的范围。
凝胶
胶浓度（%）
线状DNA分子的有效分离范围
溴酚兰*
琼脂糖
0.3
5~60 (kb)
0.7
0.8~10
0.9
0.5~7
1.2
0.4~6
1.5
0.2~4
2.0
0.1~3
PAG
3.5
100~2000 (bp)
100
5.0
80~500
65
8.0
60~400
45
12.0
40~200
20
15.0
25~150
15
20.0
6~100
12
*指迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）
3、电场强度和电场方向：
低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。随电场强度增加，高分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增加，使凝胶的有效分离范围缩小。对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨力和整齐的带型。如果电场呈周期性变化，各种分子量的DNA片段为适应新的电场变化所需的时间将不同，分子量越大，则所需的时间越多。因此可以通过脉冲电场凝胶电泳分离极大片段的DNA。
4、电泳环境
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。Tris-Cl缓冲体系中，由于Cl－的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常采用含EDTA的Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）和Tris-磷酸（TPE）三种缓冲体系。传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。TBE与TPE有较高的缓冲能力，现多用，但因TBE中硼酸易与琼脂糖形成复合物，在短时间（≤5h）琼脂糖凝胶电泳时，常用TAE，而在PAGE中常用TBE。双链线状DNA在TAE中迁移速率比TBE或TPE中快将近10%，但各个缓冲体系的分辨能力几乎相同，（对超螺旋DNA，在TAE 中的分辨率比在TBE中的更好）。凝胶电泳后要回收DNA片段，不宜采用TPE缓冲体系，这使DNA片段含较高的磷酸盐、易与DNA一起沉淀，而影响一些酶反应，缓冲液中含EDTA，目的在于螯合二价离子，抑制核酸酶以保护核酸。
缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。
缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带负电荷，向正极泳动。
在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。
二、核酸电泳的指示剂与染色剂
【指示剂】
电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程，核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚兰，呈蓝紫色；二甲苯青，呈蓝色。溴酚蓝分子量为670道尔顿，在不同溶液凝胶中，迁移速度基本相同，其分子筛效应小，近似自由电泳。在0.6%、1%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1kb 0.6kb 0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。在5%的PAG和含7~8mol/L尿素PAG中，分别与65mer和35mer的寡聚核苷酸迁移率相同。
二甲苯青的分子量为554.6道尔顿，其荷电量比溴酚蓝少，在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢，在0.1%琼脂糖凝胶电泳中迁移率相当于4kb的双链线性DNA片段。在5%的PAG和含7~8ml/L尿素PAG中迁移率分别相当与260mer和130mer的寡核苷酸。
指示剂一般加在电泳上样缓冲液中，为确保进入样品孔中，还需加入适量的蔗糖，甘油或聚蔗糖400以增加密度。
【染色剂】
电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：
1、溴化乙锭（ethidium bromide, EB）
最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。
在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光易分解，应于4℃避光保存，
2、吖啶橙（acridine orange, AO）：
吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。
3、银（Ag+）试剂：
Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA片段回收的制备。
4、亚甲蓝（methylene blue）
可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为250ng。
三、DNA的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对DNA电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10~500bP）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。
【原 理】
DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng的DNA）。如有必要可从凝胶回收DNA片段，用于分子克隆或探针标记等操作。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约200bp~50kb。
【试剂与材料】
1、5×TBE 缓冲液（pH8.3）
89mmol/L Tris
89mmol/L 硼酸
2mmol/ L EDTA
2、0.5×TBE缓冲液（pH8.3）
3、溴化乙锭（EB）：5mg/ml
4、1~2%琼脂糖凝胶：琼脂糖1~2克加0.5×TBE缓冲液至100ml，于锥形瓶中水浴煮沸20~30min或微波炉加热熔解备用。
5、6×上样缓冲液：（4℃保存）
0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，30%甘油溶于水中
6、DNA分子量标准
【操作步骤】
1、琼脂糖凝胶板的制备：将1~2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到60~70℃加EB至浓度0.5μg/ml，倒入封好的凝胶槽，厚度约3~5mm，在距底板0.5~1mm的位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，可用吸管小心吸出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1~2mm为止。
2、加样：样品中加1/5体积的上样缓冲液，混匀，取10~15μl加入凝胶点样孔中，同时要设立合适的DNA分子量标准物。
3、电泳：电压＜10V/cm，电泳至溴酚兰移出样品槽到凝胶板的2/3距离时，关闭电源。
4、取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红的DNA区带。
【注意事项】
1、加样时枪头不要碰坏孔壁，否则DNA带型不整齐。大多情况下，加样时不必更换枪头，可在阴极槽中反复吸打电泳缓冲液清洗，但对Southern印迹转移和需回收DNA时，应每个样品使用新的枪头，以避免样品交叉污染。
2、上样缓冲液不仅提高样品的密度，使样品均匀沉到样孔底，还使样品带色，便于上样，估计电泳时间和判断电泳位置。
3、EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液也不应直接倒下水道，用后妥善净化处理：EB含量大于0.5μg/ml溶液先用水将EB浓度稀释至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳，不时轻轻摇荡混匀，室温放置1小时，滤纸过滤将活性碳与滤纸密封在塑料袋中作为有害废物丢弃。或用专用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附过夜，再焚烧袋子即可。
4、应在暗箱窗口观察结果，避免紫外线操作者的损伤。
5、电泳过程中，EB向阴极移动（与DNA相反），延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5μg/ml EB溶液中重新染色后检测。
6、加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1~0.5μg即可有良好的观察效果。如样品为酶切产物（由大小不同的DNA片段组成），每孔加20~30μg DNA也不致明显影响分辨率。
7、小的凝胶——微型凝胶和中型凝胶的电泳一般比大的凝胶要快，常常用于快速分析。当选择微型或中型凝胶装置时要考虑凝胶槽盛装缓冲液的体积，小胶通常要在高压下电泳（<10V/cm），所以选择一个相对较大的缓冲液槽比较有利。
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel PAG）是通过丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙酰胺（Bis）在一个适当的自由基催化的作用下共聚合而成的高分子多孔化合物。常用聚合方法有化学聚合和光聚合两种。化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵（AP），此外，还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，常用的加速剂为四甲基乙二胺（TEMED）。PAG网孔大小与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰铵的浓度有关。此外，凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度等也与Acr和Bis的比例有关。一般根据分离的DNA分子量大小选择适当凝胶范围。
PAG常规灌制于两块封闭的平板之间，进行垂直电泳，其制备及电泳都比琼脂糖凝胶更费事，但相比之下具有以下优点：①分辨率很强，相差1bp的DNA分子即可分开；②样品槽装载DNA量大，多达10μg DNA而不明显影响分辨力；③回收DNA纯度提高，可适于最高要求的实验；④无色透明，紫外线吸收低，抗腐蚀性强，机械强度高，韧性好。
常用的是两种PAG：
1、用于分离和纯化双链DNA片段的非变性PAG；
2、用于分离和纯化单链DNA片段的变性PAG。
方案一 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
【原 理】
非变性聚丙烯酰胺凝胶，用于分离和纯化小分子双链DNA片段（&1000bp），大多双链DNA在此胶中的迁移率大略与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成和序列的影响，同等大小的DNA分子可能由于空间结构的不同而迁移率相差10%，故不能用它来确定双链DNA的大小。
【试剂及配制】
1、30%丙烯酰胺
丙烯酰胺 29g
N，N'-——甲叉双丙烯酰胺 1g
加水到100ml，加热至37℃溶解，室温避光保存，贮存期间检查溶液的pH值≤7.0。
2、5×TBE（pH8.3）
Tris碱 54 g
硼酸 27.5 g
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20 ml，加水定容至1L。
3、10%过硫酸铵（AP）： AP 1g 加水定容到10ml，4℃下可贮存数周。
4、TEMED
5、DNA分子量标准
6、6×凝胶加样缓冲液
0.25% 溴酚蓝
0.25% 二甲苯青FF
30% 甘油
【操作步骤】
1、用洗涤剂浸泡玻璃板、填条和梳子，必要时用KOH/甲醇清洗（100ml甲醇加5g KOH配制），水洗后再用乙醇淋洗。每块玻璃板的一面都用聚硅氧烷溶液处理，以防凝胶与玻片贴紧并减少电泳完毕后卸胶时凝胶破裂的可能性。
2、装好灌胶用的玻璃片及填条，用琼脂糖封好底、左、右三边。
3、依所分离的DNA的大小来确定合适的凝胶的浓度，参见表：
制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积
试剂（ml）
制备凝胶浓度（%）
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
ddH2O
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%过硫酸铵
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
4、每100ml胶液中加入35μl TEMED，迅速混匀，用注射器注入胶床，插入梳子，应密切注意胶内不要有气泡，检查有无凝胶渗漏。
5、室温下聚合至少30min，若聚合完全，梳齿下可见二条折光线，小心拔出梳子，用水冲洗样品孔。
6、在电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔，并用缓冲液稍淋洗样品孔。
7、加上1/6体积6×上样缓冲液与DNA样品及DNA分子量标准液中混合，用微量进样器吸取，小心快速地加入加样孔中（一般加样量3~5μl）。
8、接上电极，以5V/cm（1~8V/cm）的电压进行电泳。
9、参照染料迁移至所需位置时，切断电源，取出凝胶床，小心撬去上面的玻璃板，检查凝胶是否完好地附在下面的玻璃板上，按下列方法之一进行染色或显影，检测DNA的位置：
①溴化乙锭染色法：聚丙烯酰胺凝胶能抑制EB的荧光量，故用该法时，DNA量须大于10ng，将凝胶和玻璃板一起放入含0.5μl EB的1×TBE缓冲液中，30~45min后取出，水洗，紫外灯下观察并照相。
②银盐染色法：灵敏度很高，适用于聚丙烯酰胺凝胶中DNA和RNA的染色。凝胶先在50%甲醇、10%乙酸中浸泡30min；50%甲醇、7%乙酸中30min；10%戊二醛中固定30min；用水洗去多余的固定剂，然后用0.1%硝酸银浸泡30min，在100ml 3%碳酸钠（含50μl甲醛）中显影，直到获得满意效果。加5ml 2.3mol/L柠檬酸，搅动10min，即可中止反应，用ddH2O洗涤30min后浸在0.03%碳酸钠溶液中泡10min，置封闭口袋中保存。
【注意事项】
1、凝胶以1×TBE缓冲液并以低电压1~8V/cm电泳，同时凝胶应尽可能薄，以防电泳时产热过大，引起DNA变形，导致出现“微笑”DNA区带。
2、Acr是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收并具有累积性，操作时必须戴手套和口罩。
3、核酸的PAGE通常采用连续系统，没有浓缩阶段，因此核酸样品体积不能太大。
方案二 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
【原 理】
变性聚丙烯酰胺凝胶，用于分离和纯化单链DNA（RNA）片段，这类聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）存在的情况下聚合而成的，DNA的迁移率和碱基的组成及序列无关，故可用于分离同位素标记的探针、分析SI核酸酶的产物和DNA测序等。变性PAG常用于：①测定双链DNA的长度；②回收寡核苷酸。此方法迅速、简单、分辨率高，虽然产量较低（&50%所加样品），但也足以满足大部分工作的需要。
【试剂及配制】
1、5×TBE（见方案一）
2、42%丙烯酰胺
丙烯酰胺 40g
甲叉双丙烯酰胺 2g
加双蒸去离子水至100ml。
3、TEMED
4、尿素
5、10%过硫酸铵（AP）
6、2×甲酰胺上样缓冲液
5×TBE 0.2ml
去离子甲酰胺 0.9ml
10%溴酚蓝 50μl
7、0.3mol/L乙酸钠（pH7.5）
8、TE缓冲液（pH8.0）（10mmol/LTris-Cl、1mmol/L EDTA）
【操作步骤】
1、制备PAG-尿素凝胶，按寡核苷酸长度选择适当浓度的凝胶（12%、15%、19%的尿素丙烯酰胺浓度分别对应被分离合适的寡核苷酸长度40~100、25~40、&25nt）。按下列混合：25.2g尿素（终浓度7mol/L），12ml 5×TBE，42%丙烯酰胺（所需量），加水至60ml，加10% AP 200μl和TEMED 30μl，混合并倒胶（避免气泡产生），在室温下聚合30min以上。
2、取出梳子，安装电泳装置，在电泳槽中加入1×TBE。1500V电压预电泳15~30min。
3、用等体积的2×甲酰胺上样缓冲液稀释样品（上样前可在90℃加热3min以除去二级结构的干扰），产生清晰的带需要10μg寡核苷酸。
4、用TBE冲洗上样孔数次洗净尿素，上样。
5、1500V电压进行电泳，当溴酚蓝迁移至凝胶底部时，停止电泳。
6、卸下玻璃板，水平放置，撬起上面的玻璃板，用保鲜膜盖住凝胶，翻转玻璃板，取出底面的板，同样用保鲜纸盖住。
7、在短波长紫外灯下观察，用干净刀片切下所需的DNA条带，将凝胶条放到小离心管中。
8、每2cm的凝胶小条加0.5ml 0.3mol/L乙酸钠，室温下在摇床中洗脱过夜。
9、将溶液转移到另一干净管中，避免吸取凝胶碎片。用酚、氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，干燥样品后再重悬于ddH2O或TE中。
【注意事项】
1、预电泳是为了使AP迁移出样品孔，并将凝胶加温至最适于DNA电泳的温度。
2、第7~9步为了回收DNA的方法。
