原理
琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术,可用于分离,鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合,在紫外灯下可看到荧光条带,籍此可分析实验结果。
仪器与器材
1. 电泳仪
2. 水平式核酸电泳槽
3. 紫外灯
试剂与材料:
1. 琼脂糖
2. 6×点样缓冲液:0.25%溴酚兰、40%蔗糖
3. DNA分子量标准:λDNA分子量标准:λDNA/HindⅢ
4. 50×TAE电泳缓冲液贮存液配方:(50×)每升
242g Tris
57.1ml 冰醋酸
100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
1×缓冲液浓度:0.04mol/L Tris HAc、0.002mol/L EDTA
5. 0.8%琼脂糖:0.8g琼脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解
6. 10mg/ml EB 1.0g 溴乙锭
100ml 三蒸水
操作步骤:
1. 将凝胶成形模具两端用医用胶布封好,水平放置,将选好的梳子放好,梳子底部与模具之间留1mm空间。
2. 称取DNA电泳用琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧瓶中,加入100ml 1×TAE缓冲液,混匀后,将烧瓶置于电炉上,加热煮沸,直至琼脂糖完全溶解。
3. 关闭电炉,取下三角烧瓶,将其置室温下冷却至70℃左右(手握烧瓶可以耐受),再加入溴化乙锭(10mg/ml)5μl,混匀后,即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml。
4. 室温下待凝胶完全凝固,需时约30分钟,揭去二端胶布,拔出梳齿,将胶板放入电泳槽中。
5. 在电泳槽加入1×TAE缓冲液,以高出凝胶表面2mm为宜。
6. 取Ep管三支,标号,如下表所示准备电泳样品。
1
2
3
样品
λDNA/HindⅢ
未酶解质粒
酶解质粒
10μl(1r)
10μl(~2r)
10μl(~2r)
6×点样液
2μl
2μl
2μl
原理
琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术,可用于分离,鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合,在紫外灯下可看到荧光条带,籍此可分析实验结果。
仪器与器材
1. 电泳仪
2. 水平式核酸电泳槽
3. 紫外灯
试剂与材料:
1. 琼脂糖
2. 6×点样缓冲液:0.25%溴酚兰、40%蔗糖
3. DNA分子量标准:λDNA分子量标准:λDNA/HindⅢ
4. 50×TAE电泳缓冲液贮存液配方:(50×)每升
242g Tris
57.1ml 冰醋酸
100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
1×缓冲液浓度:0.04mol/L Tris HAc、0.002mol/L EDTA
5. 0.8%琼脂糖:0.8g琼脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解
6. 10mg/ml EB 1.0g 溴乙锭
100ml 三蒸水
操作步骤:
1. 将凝胶成形模具两端用医用胶布封好,水平放置,将选好的梳子放好,梳子底部与模具之间留1mm空间。
2. 称取DNA电泳用琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧瓶中,加入100ml 1×TAE缓冲液,混匀后,将烧瓶置于电炉上,加热煮沸,直至琼脂糖完全溶解。
3. 关闭电炉,取下三角烧瓶,将其置室温下冷却至70℃左右(手握烧瓶可以耐受),再加入溴化乙锭(10mg/ml)5μl,混匀后,即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml。
4. 室温下待凝胶完全凝固,需时约30分钟,揭去二端胶布,拔出梳齿,将胶板放入电泳槽中。
5. 在电泳槽加入1×TAE缓冲液,以高出凝胶表面2mm为宜。
6. 取Ep管三支,标号,如下表所示准备电泳样品。
1
2
3
样品
λDNA/HindⅢ
未酶解质粒
酶解质粒
10μl(1r)
10μl(~2r)
10μl(~2r)
6×点样液
2μl
2μl
2μl
7. 将上面三管样品置震荡器上混匀,短暂离心。
8. 用加样器吸取样品。依序分别加入三个点样孔中,注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中,不可刺穿凝胶,也要防止将样品溢出孔外。
9. 接通电源,调节电压至50伏,电泳90分钟后,将凝胶板取出,在紫外灯下观察结果。
注:1. 细菌噬菌体λDNA全长49.01kb,其序列及酶切位点已研究清楚,它经不同的限制性内切酶消化后可产生不同的电泳带图谱。因为每条区带的DNA长度是已知的,所以被选为基因工程中常用的DNA分子大小标准,与其进行比较计算,即可得到待测DNA片断的长度,λDNA经HindⅢ消化后产生7条区带,依次为23.7;9.46;6.75;4.26;2.26;1.98;0.58(kb)
2. 溴化乙锭为一种有毒试剂,使用时一定要戴手套操作,注意防护。
附注:
影响DNA片段琼脂糖电泳的几个因素:
1. DNA分子的大小:线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。
2. 琼脂糖浓度:一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反,在一定浓度的琼脂糖凝胶中,不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA,应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶浓度
可分辨的线性DNA片段大小(kb)
0.4
5~60
0.7
0.8~10
1.0
0.4~6
1.5
0.2~4
1.75
0.2~3
2.0
0.1~3
3. DNA分子的形态:在同一浓度的琼脂糖凝胶中,超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快,线性DNA分子比开环DNA分子快。
4. 电流强度:每厘米凝胶电压不超过5V,若电压过高分辨率会降低,只有在低电压时,线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。