一、原理
限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。与核酸外切酶相比,该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断,产生带有粘性或平头末端的DNA片段。把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割,即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。如果同时用两种不同的酶切割,则可产生带不同粘性末端的片段,通过电泳分离出所需要的目的基因片段。把目的基因与切开的载体DNA混合,再经过DNA连接酶处理,转化和筛选即可得到希望的重组子。
进行DNA酶切时,根据具体情况可用单酶切或双酶切。特定的酶有其配套的缓冲液。进行双酶切时,应选用两种酶都适合的缓冲液;如果两种酶要求的温度不同时,先在较低温度下酶切,然后在较高的温度下酶切。
二、目的
了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构,掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。
三、材料、试剂与器具
1、DNA样品。
2、限制性内切酶。
3、10×限制性内切酶反应缓冲液。
4、无菌双蒸水。
5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。
6、10×TBE buffer。
7、琼脂糖。
8、溴化乙锭溶液。
9、上样缓冲液(40%蔗糖,0.25%溴酚兰)。
10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。
11、10mg/ml Rnase。
四、操作步骤
1、将在-20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出,放在冰浴上融化待用。
2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分:
DNA样品 0.1-2mg
10×内切酶反应缓冲液 1ml
内切酶1 1ml
内切酶2 1ml
加无菌水至 10ml
3、离心1秒钟,使管壁上的溶液集中到管底。用手指轻弹管底部位使之混合,再离心一次,使管壁上的溶液集中到一起。
4、在37℃温育60-120分钟。
5、加1/10体积0.5M的EDTA(pH 8.0)混合,终止反应。
6、与1/5体积的样品缓冲液混合。
7、琼脂糖凝胶电泳分析(https://shiyan.ebioe.com/DNAagarosegel-electrophoresis.htm)。