基因组DNA文库用途十分广泛，如用于人类及动植物基因组学研究，基因表达调控研究，分析、分离特定的基因片段等。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为四大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）
毫无疑问，高质量的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。需要通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离 过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA
根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体，合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体，合适的片段长度平均为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：
（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
（2）电泳以后，应尽量缩短用紫外光照射目标DNA的时间，否则会显著降低克隆效率。
（3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。
三、载体的选择
目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）。选用何种载体可以参考如下几个因素：
1、目标区域的大小：
如果基因组的目标区域很小（小于50kb），那么可以选择黏粒载体甚至λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，可以方便的构建黏粒载体文库。
如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如商业化的一系列BAC载体及配套试剂盒。
如果目标区域非常大（大于250kb），那么YAC载体就是首选了。不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难。
表1 各种载体的比较
载体
容量（kb）
宿主
导入细胞方式
黏粒
30-45
大肠杆菌
转导
P1
70-100
大肠杆菌
转导
PAC
130-150
大肠杆菌
电转
BAC
120-300
大肠杆菌
电转
YAC
250-400
酵母
转化
2、筛选文库的难易程度：
黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库，如P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。
3、 载体拷贝数的考虑：
当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。对这一矛盾的解决方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系统，CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。
四、将基因组DNA片段连接入载体
使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体。许多商业化载体已经经过预处理，可以直接使用，无需内切酶消化及脱磷酸化处理。选用连接快、效率高的连接酶，连接反应体系以100μl为宜。
注意：BAC载体连接完以后，需要将连接产物做脱盐处理，除去连接反应缓冲液里的盐分。
五、将重组载体转入宿主细胞
如果构建黏粒文库，需要用包装蛋白来包装上述的连接反应产物，测定包装好的黏粒克隆的滴度，然后转染。挑出重组子，鉴定插入片段的大小。如果文库的大小和质量都令人满意的话, 就可以铺板进行文库筛选，或者扩增、保存文库。
如果构建BAC文库，应选择电转法，将上述连接产物转入受体菌，涂板长出克隆。获得克隆后需要对BAC克隆的大小进行评估，确定文库大小是否能够满足要求。如果文库大小合适，就可以进行后续操作了。
六、文库克隆数的确定
基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定：
N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率，f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。
举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为
N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = 138,298
基因组DNA文库用途十分广泛，如用于人类及动植物基因组学研究，基因表达调控研究，分析、分离特定的基因片段等。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为四大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）
毫无疑问，高质量的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。需要通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离 过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA
根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体，合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体，合适的片段长度平均为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：
（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
（2）电泳以后，应尽量缩短用紫外光照射目标DNA的时间，否则会显著降低克隆效率。
（3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。
三、载体的选择
目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）。选用何种载体可以参考如下几个因素：
1、目标区域的大小：
如果基因组的目标区域很小（小于50kb），那么可以选择黏粒载体甚至λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，可以方便的构建黏粒载体文库。
如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如商业化的一系列BAC载体及配套试剂盒。
如果目标区域非常大（大于250kb），那么YAC载体就是首选了。不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难。
表1 各种载体的比较
载体
容量（kb）
宿主
导入细胞方式
黏粒
30-45
大肠杆菌
转导
P1
70-100
大肠杆菌
转导
PAC
130-150
大肠杆菌
电转
BAC
120-300
大肠杆菌
电转
YAC
250-400
酵母
转化
2、筛选文库的难易程度：
黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库，如P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。
3、 载体拷贝数的考虑：
当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。对这一矛盾的解决方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系统，CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。
四、将基因组DNA片段连接入载体
使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体。许多商业化载体已经经过预处理，可以直接使用，无需内切酶消化及脱磷酸化处理。选用连接快、效率高的连接酶，连接反应体系以100μl为宜。
注意：BAC载体连接完以后，需要将连接产物做脱盐处理，除去连接反应缓冲液里的盐分。
五、将重组载体转入宿主细胞
如果构建黏粒文库，需要用包装蛋白来包装上述的连接反应产物，测定包装好的黏粒克隆的滴度，然后转染。挑出重组子，鉴定插入片段的大小。如果文库的大小和质量都令人满意的话, 就可以铺板进行文库筛选，或者扩增、保存文库。
如果构建BAC文库，应选择电转法，将上述连接产物转入受体菌，涂板长出克隆。获得克隆后需要对BAC克隆的大小进行评估，确定文库大小是否能够满足要求。如果文库大小合适，就可以进行后续操作了。
六、文库克隆数的确定
基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定：
N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率，f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。
举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为
N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = 138,298
技术支持资料：
材料
缓冲液和溶液
- 碱裂解液I , 4°C
50 mM 葡萄糖
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
配制碱裂解液I 约100ml，灭菌，保存在四度。
- 碱裂解液II，新鲜配置，室温保存
0.2 N NaOH （从10N的NaOH新鲜制备）
1% (w/v) SDS 碱裂解液II应该新鲜配制，室温保存。
- 碱裂解液III, 4°C
5M 醋酸钾，60ml
冰醋酸，11.5ml
SDW，28.5ml - 酒精
- 70%酒精 - 异丙醇 - 酚：氯仿（1：1， v/v）
- 醋酸钠 （3M,pH5.2）
- STE，4°C
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
0.1 M NaCl
1 mM EDTA (pH 8.0)
- TE (pH 8.0)
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
载体与菌株 BAC转化的大肠杆菌
培养基和抗生素 含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液体培养基
酶和缓冲液
溶菌酶
RNaseA,不含DNase
限制性内切酶和相应缓冲液
核苷酸/寡核苷酸
用于脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis）的DNA
标准参照物
凝胶/点样缓冲液
脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field gels，或者0.5%琼脂糖凝胶) 离心机/转头/离心管
其他 37摄氏度摇床
1.BAC DNA大量提取方案 （参考文献：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition）
此方案适合从500ml的菌液中提取BAC DNA，一般可以产生20-25μg纯化的DNA。
方法
1.将50μl BAC转化菌的过夜培养物接种到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃ 震荡（280rpm）培养12到16小时。
2.2500g，4℃，离心15min，收集菌体。
3.用100ml冰预冷的STE重新悬浮细菌沉淀。按步骤2方法离心收集细菌。
4.用24ml含RNase（100μg/ml）的碱性裂解液I溶解细菌。加溶菌酶至终浓度为1mg/ml。
5.加入24ml新鲜配置的碱性裂解液II。盖紧离心瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，冰裕5min。
6.加入24ml冰预冷的碱性裂解液III，盖紧瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，置冰上5min。
7.15000g，4℃，离心10min，将上清转移到另一离心瓶中，弃沉淀。
8.加等体积的酚：氯仿。轻轻翻转离心瓶数次，混匀。3000g，室温离心15min。
9.将水相移至另一离心瓶中，加入等体积的异丙醇，翻转离心瓶数次，混匀。
10.15,000g，室温离心15分钟，回收核酸沉淀。
11.弃上清，用20ml 70%乙醇漂洗沉淀。
12.弃乙醇，风干使乙醇挥发殆尽。
13.小心将BAC DNA沉淀溶于0.2ml TE (pH8.0) 中。
2.BAC DNA的小量提取 （参考文献：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition）
此方案适合从5ml菌液中提取BAC DNA，一般可以产生0.1-0.4μg的BAC DNA。
方法： 1.挑取单菌落接种至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中，37℃剧烈震摇过夜。
2.2000g，4℃，离心5min，收集菌体。
3.在每个离心管中加5ml预冷的STE，用移液器吹悬细菌沉淀。按步骤2离心收集细菌。
4.将菌体重悬于200ul冰冷的碱性裂解液I中。将菌体转移至预冷的微量离心管中，置于冰上。
5.向管中加入400μl新鲜配置的碱性裂解液II。轻轻翻转数次，将离心管置于冰上。
6.向管中加入300μl冰冷的碱性裂解液III，轻轻翻转数次。将离心管置于冰上5min。
7.在微量离心机上以最大速度4℃离心5min，除去细胞碎片沉淀。将上清移入一新的微量离心管中。室温下加入900μl异丙醇，轻轻翻转数次离心管，混匀。
8.立即在微量离心机上室温下最大速离心5min，使核酸沉淀。弃去上清，用1ml 70%乙醇小心漂洗。室温下离心2min，吸去乙醇。室温干燥沉淀5-10min后，将沉淀溶于50μl TE（pH8.0）中.
