cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成

2010-03-21 21:23 · Duke

构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组,基因克隆的重要方法,而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA,在这个逆转录过程中,模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于

构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组,基因克隆的重要方法,而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA,在这个逆转录过程中,模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mRNA来讲,一是丰度,二是纯度,丰度愈高,纯度越好,合成效率越好。在逆转录酶作用下,以Oligo(dT)或寡聚6核苷酸(随机)为引物,进行cDNA第一链的合成。而第二链的合成有自身引物合成,外加引物合成及置换合成,本实验采用置换合成法进行,即在RNaseH作用下,部分降解RNA,再用DNA多聚酶Ⅰ产生的DNA片段取代,以合成第二条链。

一:仪器:

恒温水浴,离心机、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪

二:试剂:

cDNA合成试剂盒、饱和酚、氯仿/异丙醇、EDTA、乙醇、3M NaAC pH 5.2、TE缓冲液

三:操作

1:第一链的合成:

a:在灭菌的DEPC处理Eppondef管中,分别加入:

模板样品mRNA 1μg

引物(0.5μg/μl) 1μl(6碱基随机引物 或oligdt)

加水至10μl

b:70℃5-10分钟,冰浴冷却5分钟

c:在上管中,根据下表依次序分别加入

5×第一链缓冲液4μl

核酶抑制剂40μ

40mM焦磷酸钠2μl

AMV反转录酶20 μ

加水至20μl

d:敲打混合,离心后放于37℃或42℃60分钟。

e:反应完毕后,将反应管置于冰浴。用于第二链合成。

注:引物可为特异引物(构建特异文库)、olig0(dt)15引物或6核苷酸随机引物,但不同引物RT时温度不同,前两种在42℃下进行,而随机引物则在37℃下进行。

构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组,基因克隆的重要方法,而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA,在这个逆转录过程中,模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mRNA来讲,一是丰度,二是纯度,丰度愈高,纯度越好,合成效率越好。在逆转录酶作用下,以Oligo(dT)或寡聚6核苷酸(随机)为引物,进行cDNA第一链的合成。而第二链的合成有自身引物合成,外加引物合成及置换合成,本实验采用置换合成法进行,即在RNaseH作用下,部分降解RNA,再用DNA多聚酶Ⅰ产生的DNA片段取代,以合成第二条链。

一:仪器:

恒温水浴,离心机、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪

二:试剂:

cDNA合成试剂盒、饱和酚、氯仿/异丙醇、EDTA、乙醇、3M NaAC pH 5.2、TE缓冲液

三:操作

1:第一链的合成:

a:在灭菌的DEPC处理Eppondef管中,分别加入:

模板样品mRNA 1μg

引物(0.5μg/μl) 1μl(6碱基随机引物 或oligdt)

加水至10μl

b:70℃5-10分钟,冰浴冷却5分钟

c:在上管中,根据下表依次序分别加入

5×第一链缓冲液4μl

核酶抑制剂40μ

40mM焦磷酸钠2μl

AMV反转录酶20 μ

加水至20μl

d:敲打混合,离心后放于37℃或42℃60分钟。

e:反应完毕后,将反应管置于冰浴。用于第二链合成。

注:引物可为特异引物(构建特异文库)、olig0(dt)15引物或6核苷酸随机引物,但不同引物RT时温度不同,前两种在42℃下进行,而随机引物则在37℃下进行。

2:第二链的合成

a:第一链合成完毕后,直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入

2.5×第二链缓冲液40μl,

DNA聚合酶Ⅰ23μ

RNase H 0.8μ

加水至100μl

b: 14-16℃下放置2小时。(<3Kb时反应时间延长至3-4小时)

c:70℃,10min,点动离心,置于冰浴

d: 在样品管中加入T4DNA聚合酶2μ,37放置10分钟。

e:加入4μl 500mM的EDTA到该样品管中,然后置于冰浴上.

f: 等体积加入酚氯仿异戊醇抽上清,12000g,3min。

g: 上清液转移至一干净试管,加2V乙醇,1/10V乙酸钠,-20℃30min沉淀,12000g,15min收集沉淀,70%乙醇洗沉淀,干燥,TE复溶。

合成后的cDNA链既可经与一定的通用接头连接后,生成末端序列,也可通过一定的内切酶处理,形成一定序列的末端片断,然后(1)与未端有互补序列的λ臂-DNA连接,形成重组λ-DNA,再经体外包装形成完整λ噬菌体,经转染后,生成噬菌体cDNA文库.(2)与未端有互补序列的质粒载体连接,形成重组质粒DNA, 生成质粒cDNA文库。目前经常使用的一些载体已经商品化,商品化的λ载体主要有噬菌体左右臂、复制原点及启动序列构成,其在连接酶作用下,可直接于具相同末端序列的cDNA互补连接。cDNA末端序列的产生可通过1)可添加核苷酸后酶切;2)直接加商品接头而形成与相应噬菌体左右臂相互补的序列。不同载体有不同的末端序列,有不同的宿主菌,有不同的筛选方式,因此在进行文库包装时,一定要搞清楚这些情况,以有的放矢的进行工作.

 

 

 

cDNA合成模式图

 

 

 

 

cDNA文库构建流程

 

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