一：仪器:同cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成
二：试剂:EcoRⅠ连接子试剂盒
三：操作:
1:cDNA加接头反应
a:按下表准备反应体系
10×缓冲液T4DNA连接酶3μl
BSA 3μl
cDNA 2.5μl
连接子 1μl
T4DNA连接酶 1μl
加水至 30μl
b: 15℃保温6-18小时
c:70℃加热10分钟后放置于冰浴
2:磷酸化反应
a:按下表准备反应体系
上述1.a反应物 30μl
T4磷酸激酶10×缓冲液 4μl
0.1mM ATP 2μl
T4激酶(10μ/μl) 1μl
水 3μl
总体积 40μl
b:37℃保温30分钟。用DNA纯化柱纯化带接头的cDNA
c: 用1ml Sephacryl S-400装柱，TEN缓冲液平衡拄，平衡液流干后，加套管，800g5min
d: 上样,用1mlTEN缓冲液洗柱2次,收集洗脱液。洗脱时加套管，800g5min
e：合并洗脱液.
D：3M NaAC和无水乙醇沉淀，干燥复溶
