重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称基因克隆。重组的DNA分子也能够在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质的表达。
一、DNA重组
重组DNA分子的构建所需的目的基因或DNA片段可来自基因组DNA、cDNA以及人工合成的DNA片段；载体最常用的是质粒、噬菌体及逆转录病毒等；它们在限制性内切酶的作用下，可形成粘性末端或平齐末端，在DNA连接酶的作用下可连接成一个DNA重组体。
（一）目的DNA片段与载体的连接
主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体遗传性状的目的。DNA克隆的一项关键技术就是DNA重组技术，所谓DNA重组，就是指把外源目的基因“装进”载体过程，即DNA的重新组合。这种重新组合的DNA叫做重组体，因为是由两种不同来源的DNA组合而成，所以又称异源嵌合DNA。
载体在DNA克隆中是不可缺少的，目的基因片段与之共价连接形成重组体后，才能进入合适的宿主细胞内进行复制和扩增。作为载体DNA分子，必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达能力，这样，外源目的基因装入该载体后，才能在载体的带动下一起复制，达到无性繁殖的目的；载体分子不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯；载体上应具有两个以上的容易检测的遗传标记，以区分阳性重组分子和阴性重组分子。选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成嗜菌斑的能力等；载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点，以便从中选出一种酶，使它在目的基因上没有切点，保持目的基因的完整性。载体上的酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否连进载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，便于筛选重组体。
DNA重组本质上是一个酶促生物化学过程， DNA连接酶是其中的重要角色。DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步：首先ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶中赖氨酸的氨基形成磷酸-氨基键而连接产生酶-ATP复合物；然后酶-ATP复合物活化DNA链5’端的磷酸基团，形成磷酸-磷酸键；最后DNA链3’端的羟基活化并取代ATP，与5’端磷酸基团形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。大肠杆菌 DNA连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子是NAD +而不是ATP。
具有相同粘性末端的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，连接酶利用这个相对稳定的结构，行使间断修复的功能，就可以使两个DNA分子连接在一起。
大肠杆菌 DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，但T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即使两端平端的双链DNA分子连接起来的功能。对于这种连接反应的机理目前还不清楚，总的来说这种连接的效果比粘性末端的连接效果要低的多，可能是因为末端DNA分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。可通过增加DNA的浓度或提高T4噬菌体DNA连接酶浓度来提高平末端的连接效率。
连接反应的一项重要参数是温度。理论上说，连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即12～16℃。此时既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。
进行DNA重组的方法有很多，主要有粘端连接法、平端连接法，后者包括平接法和接头法以及粘-平端连接法。这些方法的采用主要依据外源DNA片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA上限制酶酶切位点的性质来做选择。
1.粘性末端连接法：
若目的基因或DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同一种内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。粘性末端连接（cohesive end ligation）得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切位点，因此，可以使用原切割内切酶，重新将插入片段从重组体上完整地切割下来。
在粘性末端连接时，除重组体外，还有一定数量的载体自身环化分子，这将产生较高的假阳性克隆背静。针对这一问题，往往需要在连接前，用牛小肠碱性磷酸酶去除载体的5’磷酸以抑制质粒DNA的自身环化。另外，如果用一种限制性内切酶切割载体和外源DNA，连接时插入片段可以两个方向插入载体中。粘性末端连接时还有一个问题是片段的多拷贝插入。欲筛选出含有正确插入方向和单拷贝插入片段的重组体，需要将重组体进行内切酶图谱分析。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用插入片段摩尔数：载体摩尔数为3：1。
2.同聚体加尾部连接法
同聚体加尾部连接法（homopolymeric tails ligation）即当目的基因或DNA片段与载体，用限制性内切酶酶切获得的是平齐末端；或者外源DNA片段和载体是两个不相配的DNA片段；此时可用末端转移酶使其中的一个DNA分子3’端上接上多聚A,另一个DNA片段3’端上接上多聚T。这样两个DNA分子的尾部可按A-T配对原则相联，并由DNA聚合酶填补空隙，最后由DNA连接酶封口成重组DNA分子。
3.人工合成接头连接法
人工合成接头连接法（artifical linker ligation）即目的基因或DNA片段的两端接上能够被某一限制性内切酶识别的DNA序列（接头），再在该酶的酶解作用下，和载体获得相同的粘性末端，并进行连接。见图7-9。
(二)重组DNA分子转入宿主细胞
体外重组生成的重组子必须导入合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。宿主细胞以大肠杆菌为代表的原核细胞和包括哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核细胞。对不同的宿主细胞应采取不同的方法导入DNA，但都以获得尽可能多的转化宿主细菌或细胞为前提。
1.重组DNA分子导入原核细胞
将重组的DNA分子引入细菌(原核细胞),使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化作用(transformation)。最常用的细菌是大肠杆菌，要选择合适的菌株。细菌在生长过程中，只有某一阶段的细菌才能成为转化的接受体，这一生理状态称为感受态（competent）。
（1）CaCl2处理以后的转化: 当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42℃短时间热冲击后吸附在细胞表面，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖，该方法的转化效率为每微克DNA可获得105-106转化子。环状DNA比线状DNA分子转化效率高1000倍左右。本法的关键是选用的细菌必须处于生长对数期，实验操作必须在低温下进行。
（2）电击法: 也称电穿孔法，电击法（electroporation）最早用于将DNA导入真核细胞，利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。除需特殊仪器外，它比CaCl2操作简单，无需制备感受态细胞，适用于任何菌株。其转化效率较高，每微克DNA可以得到109-1010转化子。
2.重组DNA分子导入真核细胞
将噬菌体、病毒或或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程称为转染（transfection）。
（1）CaCl2处理以后的转染：这是将重组的噬菌体DNA导入细胞的常规方法。这时的真核细胞一定要经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol/L）溶液处理以后成为感受态细胞，感受态细胞有摄取各种外源DNA的能力。
（2）电击法：利用脉冲电场将DNA导入受体细胞，它的导入效率受到很多因素的影响，如外加电场的强度：对大多数的哺乳动物细胞来说，一般控制在250～750v/cm较适宜；工作温度：对不同类型的细胞要求有所不同，可在0℃至25℃的范围内选择；DNA的构象和浓度：线形DNA比环状DNA要好，浓度宜控制在1～40μg/ml。此外，缓冲液的离子成分也对DNA的导入效率有一定影响，一般盐溶液的导入效果较好。对于磷酸钙共沉法等不能导入的受体细胞，高压电穿孔法是一个可解决的方法，但它需要专门的仪器设备，导入前还必须进行预实验，针对不同的对象，选择最佳条件。
（3）聚乙二醇介导的转染法：此法一般用于转染酵母细胞以及其他真菌细胞。细胞用消化细胞壁的酶处理以后变成球形体，在适当浓度的聚乙二醇6000的介导下，将外源DNA导入受体细胞。
（4）磷酸钙-DNA共沉淀法：将外源基因导入哺乳细胞中进行瞬时表达的常规方法。用磷酸钙和DNA共沉淀的方法，是将被转染的DNA和正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，磷酸钙和外源性DNA形成沉淀颗粒附着在细胞表面，通过细胞脂相收缩时裂开的空隙进入或在钙、磷的诱导下被细胞摄取，通过内吞作用进入受体细胞，从而使外源DNA整合到受体细胞的基因组中得以表达。本法适用于将任何外源DNA导入哺乳动物细胞进行瞬时表达或长期转化的研究。
（5）二乙胺乙基-葡聚糖介导的转染：二乙胺乙基（diethyl-aminoethyl, DEAE）-葡聚糖介导的作用机制依然不甚清楚，可能是DEAE-葡聚糖与DNA结合后抑制核酸酶的作用或与细胞结合后促进细胞对DNA的内吞作用。此方法比磷酸钙-DNA共沉淀法重复性好，但只适合瞬时转染实验。所需DNA量比磷酸钙共沉淀少一些。
（6）原生质体融合：外源性DNA片段与噬菌体DNA载体连接后成为重组噬菌体DNA，经噬菌体外壳蛋白包装完毕以后，成为有感染能力的噬菌体颗粒。将这些有感染能力的重组噬菌体颗粒和宿主真核细胞按一定的比例混合，在培养过程中利用噬菌体的主动感染能力，将重组噬菌体DNA导入真核细胞宿主中，依照噬菌体的生活周期，重组噬菌体DNA能在宿主真核细胞中大量复制。该方法步骤简单，且转染效率较高，每微克可得到107转化子。
（7）脂质体法：脂质体（liposomes）是一种人造膜泡，可作为体内、体外物质转运载体。它的化学成分是带正电荷的N-[1-（2，3-二油酰氧）丙基]-N，N，N-三甲铵硫酸二甲酯和二油酰磷脂酰乙胺，与DNA或RNA上带负电的磷酸基团结合，形成由阳离子脂质包裹DNA的颗粒，随后脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过二者的融合将外源基因导入细胞。脂质体介导外源性DNA的转移，可提高转染的效率。它是最简单的转染方法并且脂质体对细胞生长的影响微乎其微。
（8）细胞核的显微注射法：将外源基因的重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中并进行表达，但这方法需一定的仪器和操作技巧。
外源基因导入原核细胞和真核细胞方法很多，可根据具体情况进行选择。
二、重组子的筛选与鉴定
当一个基因重组的连接反应混合物去转化或感染受体菌后，可以产生千千万万个转化菌，因此，必须从宿主细胞中筛选出含有阳性重组DNA的细胞,并鉴定重组DNA的正确性。
（一）根据载体的性状变化进行筛选
1.根据载体的抗药性标志筛选
这是一个主要的筛选含有重组DNA宿主细胞的方法。大多数的载体都带有抗生素的抗药基因，常见的有抗氨苄青霉素基因，抗四环素基因，抗卡那霉素基因等。当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。但是，这种只带有一种抗药基因的载体组成的重组DNA，在琼脂平板上生长成菌落是不能被区分是否是真正含有重组DNA的抑或是空载体，需要进一步的鉴定。
2、根据载体抗药性标志插入失活选择
一般的情况下选用含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。例如图7-10，pBR322质粒含有抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因，某一外源DNA片段插入在pBR322的BamHI位点，从而导致抗四环素基因失活。由此可以判断：在含氨苄青霉素或四环素的培养基中不能够生长的细菌是不含有载体或重组DNA 的，也就是说是没有转化的；在含氨苄青霉素的培养基能生长的，而在含四环素的培养基不能生长的细菌是被重组DNA转化的；在含氨苄青霉素或四环素的培养基都能生长的细菌是只含有载体，是未被重组的pBR322质粒。因此，根据菌落的不同抗药性可以筛选出含有重组DNA的菌落。
3.β-半乳糖苷酶系统
许多载体（如pUC、pGEM系列载体等）都带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列，其中含有编码β-半乳糖苷酶（β- galatosidase）基因（LacZ基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（成为α互补），产生具有酶活性的蛋白质（β-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）/5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside ,X-gal）的培养基上呈蓝色，IPTG是β-半乳糖苷酶产生的诱导剂，X- gal是发色底物.
当多克隆位点有外源DNA片段插入时，破坏此酶的N端阅读框架，产生无α互补功能的N端片段，因此在带有外源DNA片段的细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上呈白色，见图7-11 。
如果外源DNA插入片段相当短，不破坏β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的阅读框，有时产生的重组体菌落不呈白色而是呈浅蓝色。
4.根据插入的外源性DNA片段的性状进行筛选
如果外源性DNA片段可编码产生蛋白质，并且该蛋白质为细菌生命活动所必需，可利用该蛋白质的性状进行筛选。如亮氨酸是细菌生命活动所必需的，当外源性DNA片段含有合成亮氨酸的基因时，将该外源性DNA片段转入亮氨酸缺陷的细菌中，放入仅含亮氨酸的培养基中，只有能利用亮氨酸的细菌才能生长，因此，能生长的细菌即为含有外源性DNA片段。
（二）根据重组DNA的结构特征进行筛选
1.重组DNA的快速裂解、鉴定
是重组DNA的初步筛选方法，根据重组DNA大小和载体DNA大小之间的差别来区分的。当重组DNA克隆在培养基平板上长到2mm左右时，挑取菌落，加入50μl裂解液（50mmol/LTris-HCl,pH6.8;1%SDS;
2mmol/L EDTA;400mmol/L蔗糖;0.01%溴酚蓝）进行裂解，37℃下保温15分钟后，以12000r/min离心（4℃），吸上清，在1%琼脂糖胶中进行电泳分离，紫外灯下观察并比较与载体DNA片段迁移率，初步判断是否有外源DNA插入。
2.限制性内切酶图谱进行分析
当初步确定是带有外源性DNA片段的重组体菌落时，则挑少量菌落进行小量培养。然后进行快速抽提得到重组DNA，用限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳分析是否有外源DNA的插入。
3.核酸分子杂交方法进行鉴定
核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组DNA的最通用方法
常用核酸分子杂交方法及实用范围
4、PCR扩增方法进行鉴定
根据已知插入的外源性DNA片段的序列，设计出相应的引物；也可根据一些载体克隆位点两翼存在恒定的序列，如pGEM载体系列中双侧是SP6及T7启动子的序列，通过与SP6、T7启动子互补的通用引物对，直接用PCR对小量抽提得到重组DNA为模板，进行扩增，通过PCR产物的电泳分析可以确定是否有目的DNA的插入。利用PCR的方法除了迅速扩增特异的外源性DNA片段，还可以利用其产物进行DNA序列的直接测序。该方法目前已得到广泛的应用。
5、DNA序列分析鉴定
DNA序列分析是最后确定分离的DNA是否是特异的外源性插入DNA的唯一方法，也是最确定的方法。现在DNA序列分析已实现自动化，是一个快速、简便和实用的方法。
综上介绍的几种基因重组体筛选及最后如何确证所克隆基因序列正确性的方法。在应用时要根据具体情况选择适当的方法，本着先粗后精的原则，对重组体进行逐步的分析。
