DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。
常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。
T4DNA连接酶作用机制：
T4连接酶作用分三步：
(1) T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。
(2) 酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
(3) 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.
但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。T4 DNA 连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3
