一、DNA 的酶切与连接
(1)酶切反应:同质粒DNA 的鉴定,只不过是质粒DNA 换为载体DNA 。若大量酶切,则成比例增加。
(2)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀,-20℃2h以上。
(3)15000rpm离心15min,弃上清。
(4)加入75%乙醇洗涤2次,离心弃上清,真空抽干。
(5)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA 。
(6)测定DNA 的含量。
(7)加入线性载体DNA 和含量3~4倍于载体的待插入DNA 片段,连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl,在12~14℃反应12~16h。
(8)连接反应液可置-20℃保存,供转化用。
(9)关于待插入DNA 片段的获得参见附注。
二、大肠杆菌感受态的制备及重组DNA 的转化
1、感受态的制备
(1)接种单菌落于2ml LB培养液中, 37℃过夜。
(2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中,37℃振摇4~6h至A590=0.4~0.6。
(3)倒入50ml管内,水浴10min,以2500~3000rpm离心5min,弃上清。
(4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体,冰浴20min,同上离心弃上清。
(5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中,每管200μl,冰浴1~2h。
2、重组DNA 的转化
(1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记,然后按下述进行:
转化项目
受体菌
DNA
总体积
DNA 对照组
0
10μl
200μl
受体菌对照组
200μl
0
200μl
转化组
190μl
10μl
200μl
(2)冰浴30min至1h。中间摇动3次,以防受体菌沉底。
(3)42℃90s。
(4)37℃水浴5min。
(5)加入无相应抗生素的Lb 200μl,混匀后,37℃水浴30~60min。
(6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布,室温下干燥,然后倒置于37℃温箱中培养过夜。
三、转化子DNA 的快速鉴定-快速细胞破碎法
(1)挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中,37℃振荡培养至A590值为0.6~0.8。
(2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中,9000rpm离心9min,去尽上清。
一、DNA 的酶切与连接
(1)酶切反应:同质粒DNA 的鉴定,只不过是质粒DNA 换为载体DNA 。若大量酶切,则成比例增加。
(2)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀,-20℃2h以上。
(3)15000rpm离心15min,弃上清。
(4)加入75%乙醇洗涤2次,离心弃上清,真空抽干。
(5)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA 。
(6)测定DNA 的含量。
(7)加入线性载体DNA 和含量3~4倍于载体的待插入DNA 片段,连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl,在12~14℃反应12~16h。
(8)连接反应液可置-20℃保存,供转化用。
(9)关于待插入DNA 片段的获得参见附注。
二、大肠杆菌感受态的制备及重组DNA 的转化
1、感受态的制备
(1)接种单菌落于2ml LB培养液中, 37℃过夜。
(2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中,37℃振摇4~6h至A590=0.4~0.6。
(3)倒入50ml管内,水浴10min,以2500~3000rpm离心5min,弃上清。
(4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体,冰浴20min,同上离心弃上清。
(5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中,每管200μl,冰浴1~2h。
2、重组DNA 的转化
(1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记,然后按下述进行:
转化项目
受体菌
DNA
总体积
DNA 对照组
0
10μl
200μl
受体菌对照组
200μl
0
200μl
转化组
190μl
10μl
200μl
(2)冰浴30min至1h。中间摇动3次,以防受体菌沉底。
(3)42℃90s。
(4)37℃水浴5min。
(5)加入无相应抗生素的Lb 200μl,混匀后,37℃水浴30~60min。
(6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布,室温下干燥,然后倒置于37℃温箱中培养过夜。
三、转化子DNA 的快速鉴定-快速细胞破碎法
(1)挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中,37℃振荡培养至A590值为0.6~0.8。
(2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中,9000rpm离心9min,去尽上清。
(3)加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris