一、DNA 的酶切与连接
（1）酶切反应：同质粒DNA 的鉴定，只不过是质粒DNA 换为载体DNA 。若大量酶切，则成比例增加。
（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。
（3）15000rpm离心15min，弃上清。
（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA 。
（6）测定DNA 的含量。
（7）加入线性载体DNA 和含量3～4倍于载体的待插入DNA 片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。
（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。
（9）关于待插入DNA 片段的获得参见附注。
二、大肠杆菌感受态的制备及重组DNA 的转化
1、感受态的制备
（1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。
（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。
（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。
（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。
（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
2、重组DNA 的转化
（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：
转化项目
受体菌
DNA
总体积
DNA 对照组
0
10μl
200μl
受体菌对照组
200μl
0
200μl
转化组
190μl
10μl
200μl
（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。
（3）42℃90s。
（4）37℃水浴5min。
（5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。
（6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。
三、转化子DNA 的快速鉴定－快速细胞破碎法
（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。
（2）取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。
一、DNA 的酶切与连接
（1）酶切反应：同质粒DNA 的鉴定，只不过是质粒DNA 换为载体DNA 。若大量酶切，则成比例增加。
（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。
（3）15000rpm离心15min，弃上清。
（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA 。
（6）测定DNA 的含量。
（7）加入线性载体DNA 和含量3～4倍于载体的待插入DNA 片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。
（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。
（9）关于待插入DNA 片段的获得参见附注。
二、大肠杆菌感受态的制备及重组DNA 的转化
1、感受态的制备
（1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。
（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。
（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。
（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。
（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
2、重组DNA 的转化
（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：
转化项目
受体菌
DNA
总体积
DNA 对照组
0
10μl
200μl
受体菌对照组
200μl
0
200μl
转化组
190μl
10μl
200μl
（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。
（3）42℃90s。
（4）37℃水浴5min。
（5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。
（6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。
三、转化子DNA 的快速鉴定－快速细胞破碎法
（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。
（2）取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。
（3）加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris
