DNA重组实验方法

2010-03-06 12:55 · Byron

[实验原理] DNA重组是将外源DNA与载体分子连接,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的

[实验原理]

DNA重组是将外源DNA与载体分子连接,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶,它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起,而且能使平末端的双链DNA分子连接起来,但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

如果是单酶切,为了防止载体本身的自身连接,可以用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理,去掉酶切后5'端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化,降低转化的背景,大大提高重组子的筛出效率。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性,但是在这样的温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12-16℃,反应12-16小时 (过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。

连接产物转化宿主细胞后,还须对转化菌落进行筛选鉴定,挑选出所需的重组质粒。

[仪器、材料与试剂]

(一)仪器

1.恒温摇床

2.恒温水浴

3.恒温培养箱

4.小型高速离心机

 

(二)材料

1. 氨苄青霉素

2. BamHI

3. HindIII

4. T4 DNA连接酶

5. pQE-31 和pUC18-CAT 质粒

6. 培养皿

7. 接种针

8. 金属涂棒

9. 1.5mL 离心管

10.酒精灯

11.镊子、灭菌牙签等

(三)试剂

DNA琼脂糖胶纯化试剂盒(3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit,申能博彩公司)

[实验步骤]

(一)质粒DNA

用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。

(二)制备重组DNA

1.在灭菌的1.5mL 离心管中,加入pQE-31质粒10mL(2mg/mL),2mL酶切缓冲液,1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液(各含10个单位),无菌双蒸水7mL,至反应混合物总体积为20mL,离心混匀,37℃反应过夜。

2.在另一无菌1.5mL 离心管中,加pUC18-CAT 质粒20mL,加入3mL酶切反应液,lmL BamHI和HindIII酶的混合液,无菌双蒸水补到30mL,37℃反应过夜。

3.反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析,检验酶切是否完全。酶切完全,进行下一步。

4.将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒,分别上样跑琼脂糖凝胶电泳(注意加DNA分子量标准)。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb,后者为650bp。

5.将回收的pQE-31载体质粒均分为两份,其中一份与酶切后回收的CAT片段混合,做连接;另一份不加CAT片段,做对照。操作如下:

在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL,T4 DNA连接酶1mL,14℃(室温)过夜,然后做大肠杆菌的转化。

(三)转化感受态细胞

1.用实验一制备的感受态细胞(-20℃保存的)。

2.在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中,加入10mL连接产物,混匀,冰上放置30分钟,以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。

[实验原理]

DNA重组是将外源DNA与载体分子连接,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶,它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起,而且能使平末端的双链DNA分子连接起来,但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

如果是单酶切,为了防止载体本身的自身连接,可以用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理,去掉酶切后5'端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化,降低转化的背景,大大提高重组子的筛出效率。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性,但是在这样的温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12-16℃,反应12-16小时 (过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。

连接产物转化宿主细胞后,还须对转化菌落进行筛选鉴定,挑选出所需的重组质粒。

[仪器、材料与试剂]

(一)仪器

1.恒温摇床

2.恒温水浴

3.恒温培养箱

4.小型高速离心机

(二)材料

1. 氨苄青霉素

2. BamHI

3. HindIII

4. T4 DNA连接酶

5. pQE-31 和pUC18-CAT 质粒

6. 培养皿

7. 接种针

8. 金属涂棒

9. 1.5mL 离心管

10.酒精灯

11.镊子、灭菌牙签等

(三)试剂

DNA琼脂糖胶纯化试剂盒(3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit,申能博彩公司)

[实验步骤]

(一)质粒DNA

用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。

(二)制备重组DNA

1.在灭菌的1.5mL 离心管中,加入pQE-31质粒10mL(2mg/mL),2mL酶切缓冲液,1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液(各含10个单位),无菌双蒸水7mL,至反应混合物总体积为20mL,离心混匀,37℃反应过夜。

2.在另一无菌1.5mL 离心管中,加pUC18-CAT 质粒20mL,加入3mL酶切反应液,lmL BamHI和HindIII酶的混合液,无菌双蒸水补到30mL,37℃反应过夜。

3.反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析,检验酶切是否完全。酶切完全,进行下一步。

4.将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒,分别上样跑琼脂糖凝胶电泳(注意加DNA分子量标准)。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb,后者为650bp。

5.将回收的pQE-31载体质粒均分为两份,其中一份与酶切后回收的CAT片段混合,做连接;另一份不加CAT片段,做对照。操作如下:

在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL,T4 DNA连接酶1mL,14℃(室温)过夜,然后做大肠杆菌的转化。

(三)转化感受态细胞

1.用实验一制备的感受态细胞(-20℃保存的)。

2.在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中,加入10mL连接产物,混匀,冰上放置30分钟,以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。

[实验结果]

过夜培养后,实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落,则是好征兆,但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。

附:试剂盒说明书

3S Spin DNA Agarose Gel purification Kit

试剂盒组成:

试剂盒组成

K131(50次)

K132(100次)

K133(250次)

3S Co1umn

Collection Tube

Solution SN

Solution B

Wash Solution(a)

TE

说明书

50支

50支

30m1

10m1

22m1

10m1

1份

100支

100支

60m1

10m1

2X 22m1

10m1

1份

250支

250支

150m1

25m1

5X 22m1

10m1

1份

注:

(a)首次使用前,必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇,充分混匀后使用。每次

使用后将瓶盖盖紧,以保持Wash So1ution中的乙醇含量。

(b)TE pH8.0或者水均可以用于洗脱,测序样品请用水洗脱。

试剂盒DNA回收率:

3S柱对100bp以上的DNA片段有较好的结合性能和回收率,回收率在60%以上。

主要用途:

(a)TBE或TAE Agarose胶中回收DNA片段。

(b)从溶液中回收和浓缩DNA,去除反应体系中的蛋白质。

操作步骤

从Agarose胶中回收DNA:

1.用Agarose胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下要回收DNA的琼脂块,放入1.5m1离心管中。判定DNA 片段的位置时,要尽可能使用长波长UV,在UV下照射的时间应尽可能短。

2.按每100mg Agarose胶加入400ml Solution SN,置于55-65℃水浴中5分钟,中途混匀,至胶完全融化。胶融化后每400ml Solution SN加入100ml So1ution B,混匀。注意;高浓度的胶(1.5-2%),每100mg胶加入500ml Solution SN,加热融胶的时间延长到15分钟,以保证胶全部融化,胶融化后加入100ml SolutionB,混匀。

3.将3S柱放入2m1收集管中,将融化的胶溶液转移到3S柱中,让盖子开着,室温放置2分钟。盖上离心管盖(盖子也可以不盖,但是如果您同时有很多样品,担心混淆或弄翻溶液,建议您盖上盖子),室温离心(10,000rpm)1分钟。

4.取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一个收集管中,加入600ml Wash Solution,室温离心(10,000rpm)1分钟。

5.重复步骤4一次。

6.取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一个收集管中,室温高速离心(10000 rpm)2分钟。

7.将3S柱放入一根新的1.5m1离心管中,在3S柱子膜中央加入30ml TE或水,室温放置2分钟。注意:提高洗脱温度有利于提高DNA的洗脱效率。也可以用预热的TE或水洗脱。

8.盖上离心管盖(盖子也可以不盖,但是如果您同时有很多样品,担心混淆或弄翻溶液,建议您盖上盖子),10,000rpm高速离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA片段,可立即使用或保存于-20℃备用。

从溶液中回收和浓缩DNA:

1.根据溶液的体积和所要回收DNA的含量,加入5倍体积的Solution SN。如果溶液的体积不足100ml,加TE补足到100ml,再加500u1 Solution SN和100 ml SolutionB,混匀;

2.以下同从Agarose胶中回收DNA的步骤3-8。

关键词: