[实验原理]
DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5'端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12-16℃，反应12-16小时 (过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．恒温摇床
2．恒温水浴
3．恒温培养箱
4．小型高速离心机
(二)材料
1． 氨苄青霉素
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA连接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 质粒
6． 培养皿
7． 接种针
8． 金属涂棒
9． 1.5mL 离心管
10．酒精灯
11．镊子、灭菌牙签等
(三)试剂
DNA琼脂糖胶纯化试剂盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申能博彩公司）
[实验步骤]
(一)质粒DNA
用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。
(二)制备重组DNA
1．在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE-31质粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。
2．在另一无菌1.5mL 离心管中，加pUC18-CAT 质粒20mL，加入3mL酶切反应液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37℃反应过夜。
3．反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否完全。酶切完全，进行下一步。
4．将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。
5．将回收的pQE-31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。操作如下：
在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL，T4 DNA连接酶1mL，14℃（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。
(三)转化感受态细胞
1．用实验一制备的感受态细胞(-20℃保存的)。
2．在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。
[实验原理]
DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5'端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12-16℃，反应12-16小时 (过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．恒温摇床
2．恒温水浴
3．恒温培养箱
4．小型高速离心机
(二)材料
1． 氨苄青霉素
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA连接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 质粒
6． 培养皿
7． 接种针
8． 金属涂棒
9． 1.5mL 离心管
10．酒精灯
11．镊子、灭菌牙签等
(三)试剂
DNA琼脂糖胶纯化试剂盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申能博彩公司）
[实验步骤]
(一)质粒DNA
用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。
(二)制备重组DNA
1．在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE-31质粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。
2．在另一无菌1.5mL 离心管中，加pUC18-CAT 质粒20mL，加入3mL酶切反应液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37℃反应过夜。
3．反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否完全。酶切完全，进行下一步。
4．将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。
5．将回收的pQE-31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。操作如下：
在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL，T4 DNA连接酶1mL，14℃（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。
(三)转化感受态细胞
1．用实验一制备的感受态细胞(-20℃保存的)。
2．在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。
[实验结果]
过夜培养后，实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。
附：试剂盒说明书
3S Spin DNA Agarose Gel purification Kit
试剂盒组成：
试剂盒组成
K131(50次)
K132(100次)
K133(250次)
3S Co1umn
Collection Tube
Solution SN
Solution B
Wash Solution(a)
TE
说明书
50支
50支
30m1
10m1
22m1
10m1
1份
100支
100支
60m1
10m1
2X 22m1
10m1
1份
250支
250支
150m1
25m1
5X 22m1
10m1
1份
注：
(a)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混匀后使用。每次
使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash So1ution中的乙醇含量。
(b)TE pH8．0或者水均可以用于洗脱，测序样品请用水洗脱。
试剂盒DNA回收率：
3S柱对100bp以上的DNA片段有较好的结合性能和回收率，回收率在60％以上。
主要用途：
(a)TBE或TAE Agarose胶中回收DNA片段。
(b)从溶液中回收和浓缩DNA，去除反应体系中的蛋白质。
操作步骤
从Agarose胶中回收DNA：
1．用Agarose胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下要回收DNA的琼脂块，放入1．5m1离心管中。判定DNA 片段的位置时，要尽可能使用长波长UV，在UV下照射的时间应尽可能短。
2．按每100mg Agarose胶加入400ml Solution SN，置于55-65℃水浴中5分钟，中途混匀，至胶完全融化。胶融化后每400ml Solution SN加入100ml So1ution B，混匀。注意；高浓度的胶(1．5-2％)，每100mg胶加入500ml Solution SN，加热融胶的时间延长到15分钟，以保证胶全部融化，胶融化后加入100ml SolutionB，混匀。
3．将3S柱放入2m1收集管中，将融化的胶溶液转移到3S柱中，让盖子开着，室温放置2分钟。盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温离心(10，000rpm)1分钟。
4．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，加入600ml Wash Solution，室温离心(10，000rpm)1分钟。
5．重复步骤4一次。
6．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，室温高速离心(10000 rpm)2分钟。
7．将3S柱放入一根新的1．5m1离心管中，在3S柱子膜中央加入30ml TE或水，室温放置2分钟。注意：提高洗脱温度有利于提高DNA的洗脱效率。也可以用预热的TE或水洗脱。
8．盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，10，000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
从溶液中回收和浓缩DNA：
1．根据溶液的体积和所要回收DNA的含量，加入5倍体积的Solution SN。如果溶液的体积不足100ml，加TE补足到100ml，再加500u1 Solution SN和100 ml SolutionB，混匀；
2．以下同从Agarose胶中回收DNA的步骤3-8。
