重组质粒(dna recombinant plasmid)的筛选实验步骤

2010-03-06 17:55 · ann

实验仪器 控温摇床 水浴锅 冰箱(-20,‐70℃) 超净工作台 培养箱 实验试剂 Amp LB IPTG X-Gal 平皿 玻棒 三角瓶 离心管 移液器 tip 实验步骤: 20人/班 1平皿/人 挑取可疑的白色菌落,移植于2mL的LB中,

实验仪器

控温摇床 水浴锅 冰箱(-20,‐70℃) 超净工作台 培养箱

实验试剂

Amp LB IPTG X-Gal

平皿 玻棒 三角瓶 离心管 移液器 tip

实验步骤:

20人/班 1平皿/人

挑取可疑的白色菌落,移植于2mL的LB中,250转/分摇菌、37℃培养过夜。以快速碱法抽提质粒:

1. 取适量菌液于2ml指形管中,12000rpm/min 离心30s-1min。

2.弃上清,且用滤纸吸干。

3.加溶液I 100μL,重悬菌体(使细菌重新溶解)。振荡。

溶液I:含葡萄糖,作用形成粘度和渗透压。

含EDTA,作用是能络合Mg+、Ca ++,抑制DNA酶活性。

含Tris-HCL,作用作为平衡盐。含溶菌酶,作用是溶解细胞壁。

4. 加溶液II 200μL,反复倒转轻摇。

溶液II:含NaOH+SDS(现配现用)。作用:使溶液PH值达到12.4左右,使核酸变性,而质粒变性不严重。同时SDS能使蛋白质溶解。

5. 加溶液III 150μL,倒转轻摇匀。

溶液III:含KAC、HAC其作用是使溶液PH达到中性,染色体退火形成网状,而质粒还原成螺旋状,溶解在水中。

6.12,000r离心5分钟。

7.转移上清至另一指形管。

8.加等体积平衡酚(PH7.6以上,用Tris-NaOH调),猛烈摇匀, 12,000r离心5分钟。

9.小心转移上清至另一指形管。

10.加1/2体积平衡酚和1/2体积氯仿:异丙醇(氯仿:异丙醇为 24:1),混匀,12,000r离心5分钟。

11.重复9

12.加等体积氯仿:异丙醇抽提,12,000r离心5分钟。

13. 重复9

14.加1/10体积的3M NaAc(PH5.2)和2.5体积的无水乙醇,混匀。冰浴若干时间(时间可长可短)。NaAc使质粒(带负电)电荷减弱,易沉淀。

15.12,000r,15 分钟。

16.弃上清,用75%乙醇1ml洗沉淀。作用:去盐。

17.离心12,000r,5分钟。

18.弃上清,风干残留液。

19.加含有RNase的双蒸水30-50μL,溶解沉淀。

20.室温作用若干时间,电泳检测或置冰箱结冰层备用。

结果与分析:

根据提取质粒酶切后的电泳图谱, 具体分析是否有插入片段; 有插入片段的为重组子.

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