1实验原理
1.1聚合酶链式反应（PCR）的基本构成
PCR指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。
（1）模板DNA的变性
模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
（2）模板DNA与引物的退火
将反应混合物温度降低至 37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。
（3）引物的延伸
DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在 72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约 2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。
1.2 PCR反应的五个元素
参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg 2+ 。
1.2.1 引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
引物设计应遵循以下原则：
（1）引物长度
长度要求在15～30bp，常用为20bp左右，引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成 Tm值过高，超过酶反应的最适温度，且合成长引物还会使费用大大增加。
（2）引物碱基构成
引物的G+C含量以40～60%为宜，因为 G+C含量过高或过低都会直接造成Tm值的过高或过低，都不利PCR反应的进行。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3）引物二级结构
应尽量避免引物内部出现二级结构，并且两条引物间不能形成互补结构，特别是3’端的互补，否则形成引物二聚体，PCR扩增中产生非特异的条带。引物自身也应无回文对称结构（限制性酶切位点除外），防止形成茎环结构。
（4）引物3’端序列
3’端碱基要求与模板严格配对，连续配对的碱基数超过15bp，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
（5）引物中酶切位点的引入
引物中一般会引入一至两个酶切位点，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中，PCR克隆基因时已将后续方案设计完毕。
（6）引物的特异性
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，特别是与待扩增的模板 DNA之间要没有明显的相似序列。 （7）引物量
反应体系中引物的常用浓度为0.1～1pmol/ml，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体，过低则扩增效率会降低。
1实验原理
1.1聚合酶链式反应（PCR）的基本构成
PCR指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。
（1）模板DNA的变性
模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
（2）模板DNA与引物的退火
将反应混合物温度降低至 37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。
（3）引物的延伸
DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在 72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约 2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。
1.2 PCR反应的五个元素
参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg 2+ 。
1.2.1 引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
引物设计应遵循以下原则：
（1）引物长度
长度要求在15～30bp，常用为20bp左右，引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成 Tm值过高，超过酶反应的最适温度，且合成长引物还会使费用大大增加。
（2）引物碱基构成
引物的G+C含量以40～60%为宜，因为 G+C含量过高或过低都会直接造成Tm值的过高或过低，都不利PCR反应的进行。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3）引物二级结构
应尽量避免引物内部出现二级结构，并且两条引物间不能形成互补结构，特别是3’端的互补，否则形成引物二聚体，PCR扩增中产生非特异的条带。引物自身也应无回文对称结构（限制性酶切位点除外），防止形成茎环结构。
（4）引物3’端序列
3’端碱基要求与模板严格配对，连续配对的碱基数超过15bp，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
（5）引物中酶切位点的引入
引物中一般会引入一至两个酶切位点，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中，PCR克隆基因时已将后续方案设计完毕。
（6）引物的特异性
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，特别是与待扩增的模板 DNA之间要没有明显的相似序列。 （7）引物量
反应体系中引物的常用浓度为0.1～1pmol/ml，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体，过低则扩增效率会降低。
1.2.2 酶及其浓度
Taq DNA多聚酶是耐热DNA 聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。Taq DNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94，000 Da。具有 5’--<3的聚合酶活力，5’--<3’的外切核酸酶活力，无3’--<5’的外切核酸酶活力，会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，Taq DNA聚合酶的出错率为10-4～10-5。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
此酶具有以下特点：
（1）耐高温，在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95℃ 下反应2小时后为原来的40%。
（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。
（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb，且特异性也较高。
PCR的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片段扩增的酶，扩增长度极端可达40kb；有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶；还有针对不同实验对象的酶等。
一典型的PCR反应约需的酶量为 2.5u（总反应体积为50ml时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
1.2.3 dNTP的质量与浓度
dNTP 的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH或1M Tris。HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200mmol/l，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
1.2.4 模板（靶基因）核酸
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽）抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~10ng/ml，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。在PCR反应中，过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。
1.2.5 Mg 2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种 dNTP浓度为200mmol/l时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/l为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。一般厂商提供的Taq DNA聚合酶均有相应的缓冲液，而Mg2+也已添加，如果特殊实验应采用无 Mg2+的缓冲液，，在PCR反应体系中添加一定量的Mg2+。
1.3 PCR反应条件
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 5.1.4 PCR反应特点
（1）强特异性
PCR反应的特异性决定因素为：
A. 引物与模板DNA特异性的结合；
B. 碱基配对原则；
C. Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
D. 靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
（2）高灵敏度
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（mg = 10-6g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
（3）快速简便
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变性－退火－延伸反应，反应一般在2～4小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。
（4）低纯度模板
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
1.5 PCR结果异常分析
（1）非特异性扩增产物的出现
当扩增产物不止一种时，通常与以下几种情况有关：
A. 背景DNA与引物同源性高。可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对对扩增产物DNA再次进行PCR扩增。
B. 退火温度太低。引物和模板的配对是一个动态过程，分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到最佳配对位点上。退火温度太低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对而解离不下来，这种不正确的配对，进入PCR反应过程就可扩增出非特异性的产物DNA。提高退火的温度将可改善结果。
C. 过量的酶、引物和模板DNA可使PCR反应造成混乱，强行扩增出非特异性产物DNA，适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。
（2）无特异性扩增产物带
A. 引物溶液反复冻融或污染了DNA酶类，造成引物降解。
B. 模板DNA制备时模板已降解。
C. Taq酶有失活或有杂酶污染。
D. 缓冲液条件不当。
E. 引物不正确。
2 试剂与器材
1. 试剂 （1）模板DNA 沸水浴制备的大肠杆菌染色体DNA
（2）Taq DNA聚合酶
（3）10×缓冲液
（4）dNTP（2.5mM）
（5）Primer1（10pmol/ml）
（6）Primer2（10pmol/ml）
2. 器材 （1）eppendorf管 PCR专用薄壁管（200ml）
（2）枪头 进口（洁净度高）
（3）移液器
（4）离心机 PCR发应液混合后离心
（5）PCR仪
（6）超净工作台 提供洁净操作区用于PCR加样
5.3实验步骤
（1）按如下体积加样进行PCR反应：
1# 2#
总体积 50ml 50ml
ddH2O 28.5ml 26.5ml
10×buffer（含 Mg2+） 5ml 5ml
dNTP（2.5mM） 4ml 4ml
Primer1（10pmol/ml） 5ml 5ml
Primer2（10pmol/ml） 5ml 5ml
染色体DNA（沸水浴制备） 2ml 4ml
Taq 酶（5U/ml） 0.5ml 0.5ml
（3）取40ml采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况，扩增产物集中于1.5 kb片段的位置附近，割下该位置的凝胶进行外源DNA的回收。
