目的：
学习用CaCl2法转化感受态E.coli的方法，并能进行外源的DNA转化，同时学会用适合的条件对转化细胞进行筛选。
原理：
体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则会很快降解，而且只有导入到细胞中后，才能扩增及研究其功能的表达，细胞转化是常用也是最有效的方法之一，细菌转化是指裸露的（或纯化的）DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。凡是能吸收游离的DNA片段的细菌，称为感受态细菌，或者说处于感受态。大肠杆菌的感受态需诱导。
将对数生长期的细菌放入0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀，形成原生质球，诱导感受态；DNA加入后，形成抗DNase的基磷酸钙复合物，粘附于原生质球表面，42℃热冲击，DNA被吸收，将细胞混合物涂布于合适的（筛选）培养基几h，细胞得以恢复和复壮，转化基因得以表达，然后根据合适的选择条件可以区分转化细胞和非转化细胞。
一、材料
标准质粒DNA；重组质粒DNA；大肠杆菌JM109
二、仪器
超净工作台；高速冷冻离心机；紫外分光光度计；手提示高压灭菌锅
三、器皿
微量移液器；微量吸头；培养皿；三角瓶；离心管；微量离心管；微孔滤膜及滤器
四、试剂
LB培养基；0.1mol/LCaCl2；20mmol/LMgSO4；SOC培养基；SOB培养基；抗生素
五、方法
1、从37℃保存的新鲜平板中挑取一个大肠杆菌JM109的单菌落，转到一个含有100molLB培养基的1L烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约3h(160rpm)，为得到有效转化,活细胞数不应超过108个细胞/ml，可每隔20～30min测量OD600值来监测培养物的生长情况。
2、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，沐浴10min,使培养物冷却至0℃。
3、于4℃离心4000rpm×10min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
5、以10ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀,放置于冰浴上。
6、于4℃离心，4000rpm×10min，以回收细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
目的：
学习用CaCl2法转化感受态E.coli的方法，并能进行外源的DNA转化，同时学会用适合的条件对转化细胞进行筛选。
原理：
体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则会很快降解，而且只有导入到细胞中后，才能扩增及研究其功能的表达，细胞转化是常用也是最有效的方法之一，细菌转化是指裸露的（或纯化的）DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。凡是能吸收游离的DNA片段的细菌，称为感受态细菌，或者说处于感受态。大肠杆菌的感受态需诱导。
将对数生长期的细菌放入0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀，形成原生质球，诱导感受态；DNA加入后，形成抗DNase的基磷酸钙复合物，粘附于原生质球表面，42℃热冲击，DNA被吸收，将细胞混合物涂布于合适的（筛选）培养基几h，细胞得以恢复和复壮，转化基因得以表达，然后根据合适的选择条件可以区分转化细胞和非转化细胞。
一、材料
标准质粒DNA；重组质粒DNA；大肠杆菌JM109
二、仪器
超净工作台；高速冷冻离心机；紫外分光光度计；手提示高压灭菌锅
三、器皿
微量移液器；微量吸头；培养皿；三角瓶；离心管；微量离心管；微孔滤膜及滤器
四、试剂
LB培养基；0.1mol/LCaCl2；20mmol/LMgSO4；SOC培养基；SOB培养基；抗生素
五、方法
1、从37℃保存的新鲜平板中挑取一个大肠杆菌JM109的单菌落，转到一个含有100molLB培养基的1L烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约3h(160rpm)，为得到有效转化,活细胞数不应超过108个细胞/ml，可每隔20～30min测量OD600值来监测培养物的生长情况。
2、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，沐浴10min,使培养物冷却至0℃。
3、于4℃离心4000rpm×10min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
5、以10ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀,放置于冰浴上。
6、于4℃离心，4000rpm×10min，以回收细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
7、每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀。
8、用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200µl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA（体积小于等于10µl，DNA小于等于50ng）轻轻旋转以混匀内溶物，在冰中放置30min。
试验中一定要包括下面的对照：
A、加入已知量的标准朝螺旋质粒DNA制品的感受态细胞。
B、完全不加质粒DNA的感受态细胞。
9、将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰90s，不要摇动试管。
10、快速将管转移到水浴中，使细胞冷却1～2min。
11、每管加800µlSOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细胞复苏。
12、将适当体积（每个90mm平板可达200µl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO4和相应抗生素的SOB琼脂培养基上。如培养物体积太小（10µl），可再加肉汤培养基。用一个无菌的弯头玻璃棒轻轻的将转化的细胞涂到琼脂平板表面。
13、将平板置于室温直至液体被吸收。
14、倒置平板，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。
提示：
1、所有的菌液涂皿操作，只需一根玻璃涂布棒，用95%酒精在火焰下灭菌冷却后即可用。在涂布过程中注意避免反复来回涂布。因为感受态的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
2、目前虽然对转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室的工作表明：
（1）100mmol/LCaCl2处理可获得最高转化率。
（2）菌体在溶液的pH为6.0时最适宜。
（3）受体菌细胞与DNA混合培养为1h最佳。
（4）线性DNA存在抑制转化在作用。
（5）铺平板条件会影响转化率。
（6）受体菌对表面活性剂非常敏感，所用的玻璃离心管等用具必须严格冲洗。
（7）对不同转化菌株热处理的效应不一致。
3、欲转化的DNA与细胞单混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率将极差。
4、如果被转化的细菌为氨苄青霉素抗性，则在铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落）于37℃培养平板时不应超过20h。氨苄青霉素抗性的转化体可将β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60µg/ml增至100µg/ml,可使情况有所改善，但不能彻底根除。
