利用各种PCR技术扩增特异DNA是获得目的基因和特异探针的一种最有效、最简便的方法。但PCR扩增出的片断如不经进一步克窿是无法变成可利用基因，因此PCR扩增产物的克窿技术是DNA重组技术中的一个最重要部分，该技术是目前分子生物学实验中最重点内容，要综合前面实验中所介绍的各种技术，起着承上启下的作用。PCR产物的克隆一般要经过PCR产物的纯化、产物与载体的酶切、脱磷及连接、转化、筛选等几个步骤实现。PCR产物与载体的连接方式有实验八中提到的溶液连接和胶内连接，可粘连、平连、粘平连及与T－载体的单位点配对连接（见图9－1）。
PCR产物 PCR产物 PCR产物 PCR产物 PCR产物
（上下游引物中各带 （上下游引物中仅有（上下游引物 （PCR产物与载体
一种特异酶切位点）一种特异酶切位点） 中无酶切位点） 均有两个酶切位点
但只有一个是相同的）
PCR产物 纯化回收
PCR产物及载体 PCR产物单酶切 PCR产物Klenow酶补平PCR产物与载体 T－载体
双酶切，载体脱磷 载体双酶切、脱磷 载体用平末端酶切割 双酶切载体脱磷 单碱基
粘连 粘连, Klenow酶补平载体脱磷后平连 粘连 Klenow补平 粘连
后平连 或加接头粘连酶补平 平连
1：PCR产物克窿方式示意
粘连时载体与外源DNA的比例1：3比较合适，而平连时可达到1：10
在这些方法中，T－载体技术比较简便有效的，尤其对于一些多克隆位点的可选择内切酶种类稀少的表达载体该技术特别适用。该方法具有不需对引物进行特殊酶切位点的修饰，即能直接进行PCR产物的克隆，并具有克隆效率高的特点。通用载体的T-载体有商品出售，一些特殊载体的T－载体可自己制备。T-载体均是通过载体是通过用EcoRⅤ或SmaI等平末端酶将相关载体切割出平端,然后再在其两个3`端加上T而构成的。这些存在于插入位点的突出的3`末端可防止载体的自身环化,并为PCR产物提供碱基配对区（因PCR扩增产物的3`末端为非特异性的A碱基）而有效地提高了PCR扩增片断的克隆效率。
本实验中用pGEMR-T载体为材料，来让学员学习T－载体克窿技术。PGEM－T载体来自于PGEM系统载体，这类载体中中含有T7和SP6RNA聚合酶的启动子系列,该系列侧翼为一多克隆位点区,该区有β-半乳糖苷酶的α-肽端的编码区。β-半乳糖苷酶的α-肽编码区的插入失活,能使重组子在指示平板上通过颜色反应加以检测。此两个载体的多克隆位点区含有多种内切酶位点,此很容易来构建嵌套缺失位点。pGEMR-T Easy载体系统的多克隆位点两侧都存在EcoRⅠ、BstZⅠ、NotⅠ,因此该载体可通过这三类酶进行单酶切构而建重组片断; 而pGEMR-T载体系统的多克隆区两侧都有BstZⅠ酶切序列,因此用此酶进行单酶切操作,即可释放出可插入位点。除了单酶切外,这两类载体都可通过双酶切操作来形成插入位点。pGEMR-T及pGEMR-T Easy载体系统中都有嗜菌体f1的复制起始区,借此可以合成单链DNA。并可用双重反向启动子(T7,SP6)进行体外转录。在pGEMR-T系列载体系统中,外源片断的克隆将打破载体中的β半乳糖苷酶的编码序列,因此重组子可在指示平板上用颜色反应加以筛选。将外源片断克隆到pGEMR-T载体中,然后再转入感受态细胞,这样在指示平板上蓝白斑的比例将下降,在通常情况小,外源片断的插入将产生白斑,但在某些情况小,含重组子的载体也能形成蓝斑,这主要是插入片断长度(包括3`A突出末端)为3`核苷酸的倍数,且插入位点在lacZ基因的阅读框内,并插入片断不含终止密码子。这样就可能不破坏阅读框而翻译出含β半乳糖苷酶N端多肽片断的融合蛋白,与宿主菌的C端片断发生α-互补而形成蓝斑。有文献报道当重组的外源DNA片断接近2Kb时,其可能会克隆到阅读框,并产生蓝斑。即使实验中预设扩增片断并非3`核苷酸倍数,但扩增过程可能会导致核苷酸突变(缺失突变或点突变),这种片断与pGEMR-T系列载体重组后,再转化到感受态细胞中后,即有可能产生蓝斑。这点已有文献报道，因此在筛选重组菌斑时要特别注意。
T－载体的构建
一：仪器：同质粒DNA提取实验、酶切实验及RT－PCR实验
二：试剂：SmaI、其余同质粒DNA提取实验、酶切实验及RT－PCR实验
三：操作：
1：提纯载体DNA
2：将1ug提纯的PGEMDNA用SmaI1ul进行全酶切（为了切割彻底、甚至能破坏酶切位点周围碱基序列而防止自连发生，酶可过量使用，并在25℃过夜）
2：酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶
3：在上述酶切反应后复溶的含1ugDNA的Eppendof管中加入
10× PCR缓冲液 5ul
10mM dTTP 10ul
1mg/mlBSA 10ul
5U/ul Taq酶 0.5ul
加水至50ul
70℃2小时，酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶
此载体即可直接用于PCR产物的克隆。
PCR产物的T－载体克隆
一：仪器
同连接、转化实验
二：试剂
T－载体，其余同连接、转化实验
三：操作：
1:PCR产物的纯化见上
2：PCR产物的克隆用自制或购置的T－载体按下述比例进行连接反应
反应体系 阴性对照体系 背景对照体系
10×T4DNA连接酶缓冲液 1 1 1
T－载体1 1 1
PCR产物 X(计算见附) 0 0
阴性对照DNA（500bp 4ng/ul ） 0 2 0
T4DNA连接酶（3u/ul） 1 1 1
加水至10ul
3：4℃过夜
4：T－载体与外源片断连接后的转化见实验二二与二三
附：连接反应中PCR产物用量的确定
1：待重组片断与载体间的最佳分子比
T载体与待克隆的对照DNA间的最佳分子比为1:1。一般分子比从1:8到8:1都是适合的。如果在实验开始前,没有确定载体与待克隆片断间的最佳分子比,那么有必要在实验时将最佳比给确定下来。3:1-1:3的比值在大多数情况下都能得到较好的实验结果。PCR扩增后的片断其浓度在实验时也必须确定,确定其浓度的方法为或通过凝胶电泳后对待测片断与一系列成梯度的已知浓度的DNA相比较而确定,或可通过比色法确定。
2：连接反应中待扩增片断的用量可通过下列公式计算
X=A×B×D/C
a=载体的ng数、b=待克隆片断的碱基数Kb、c=载体碱基数Kb
d=待克隆片断与载体分子比（根据附1确定）、x=连接反应中待扩增片断的用量
3用pGEMR-T系列载体系统生成单链DNA方法
要诱导单链DNA的生成,应用特定的辅助嗜菌体去感染含pGEMR-T或pGEMR-T Easy载体的菌体。质粒进入f1嗜菌体的复制区,使得单链DNA象存在于包装蛋白内的病毒颗粒一样被分泌出来。这种单链DNA很容易通过沉淀和抽提方法加以提取和纯化。
注：1：在室温下,缩短保温时间,也可能是有效的操作方法,但这有可能降低克隆数。最适的连接条件为4℃过夜，因PCR产物与T－载体间的配对碱基少，高温不利于连接的进行。经验表明如连接反应高于15℃，则兰斑数大大升高，可能T载体中存在没有加上T的载体，高温下平端自连的比例增加。
2：连接酶最好用相关的经修饰纯化的T4DNA连接酶,因其他连接酶可能具核酸外切酶的活性,这样如用这种酶就有可能导致对载体3’T产生切割。
3：T4DAN连接酶的10×缓冲液中含ATP,在温度频繁波动时,此成分有可能被降解,因此要避免仅为了少量使用而对缓冲液反复冻融。如果在融化后的T4DAN连接酶10×缓冲液中出现沉淀,则应将此缓冲液振荡,以使沉淀复融。
4：重组T载体转化时最好用SOC培养基,LB培养基也能用,但转化数可能低。
5：因含β半乳糖苷酶的菌落生长速度慢于无此酶活的菌落,因此保温过夜后,蓝斑菌落要远小于白斑菌落,白斑菌落的直径近1毫米。
PCR产物的平端克隆
仪器：同上
试剂：SauI,Klenow片段,T4连接酶
操作：载体提取后用过量SmaI切割，提取、纯化
PCR反应液加热到99℃10 min，灭活Taq酶，补镁离子到5-10mM加入1u Klenow片段，70℃15min。纯化
载体与PCR产物以1：10比例16℃连接过夜
PCR反应液可直接用于连接，但最好对PCR产物纯化后进行连接，既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。
