1.目的
学会DNA片段的体外连接技术。
2.原理
在Mg2+和ATP存在下,T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。
3.器材
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,台式离心机,干式恒温气浴。
4.试剂
pUCm-T 载体,Pinpoint™xa-3酶切载体,CHI插入片断,T4 DNA 连接酶,连接酶缓冲液,无菌ddH2O。
5.实验准备
1.5ml离心管装入饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌);平板培养基(含Amp)。
6.操作步骤
1)PCR产物与pUCm-T载体直接连接:
(1) 事先将干式恒温仪(或冰盒里的水)温度设定在14~16°C。
(2) 取一个灭菌的0.2ml微量离心管,加入:
4μl PCR 产物混合液
1μl pUCm-T载体
0.5μl T4 DNA连接酶(TAKARA, 350U/ul)
1μl 连接酶缓冲液
3.5μl ddH2O
总量 10μl 体系
(3) 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心,然后置于16°C水中保温过夜。
(4) 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
2)DNA回收片断(CHI)与载体(Pinpoint™xa-3)连接:
(1) 取一个灭菌的0.2ml微量离心管,加入
4μl 回收DNA片断
1μl 酶切后回收的载体
0.5μl T4 DNA连接酶(TAKARA, 350U/ul)
1μl 连接酶缓冲液
3.5μl ddH2O
总量 10μl 体系
(2) 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心,然后置于16°C干式恒温仪(或16°C水中)中保温过夜。
(3) 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。