1.DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容
D N A 甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。甲基化通常发生在胞嘧啶的C5 位，形成5- 甲基胞嘧啶(5mC)，甲基化的胞嘧啶多位于CpG 岛上。CpG 岛是CpG 二联核苷富集区域，CG含量大于50%，长约200~500 bp。哺乳动物DNA 甲基化的模式只有5mC 这一形式，真核生物中大约2%~7% 的胞嘧啶被甲基化修饰。1. 基因组DNA 甲基化分析方法
早期的基因组DNA 甲基化分析技术，如SssI 甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等，已不能满足现代表观遗传学研究的需求。近年来常用的基因组甲基化分析方法有以下两种。
1.1 甲基化敏感扩增多态性技术
甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术由Reyna-lópez 等报道，并被用于检测双相型真菌的DNA 甲基化，它是在扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技术的基础上建立起来的。
其基本程序是：提取高质量基因组DNA，分别用EcoRI/HpaII，EcoRI/MspI 两组酶组合对基因组DNA 进行双酶切，并连上相应的限制性内切酶的接头，然后以接头序列设计的预扩增引物，进行PCR 扩增。扩增产物稀释后，再加入带有选择性碱基的引物，进行第二次PCR 扩增，扩增产物变性后在6%的序列胶上电泳，最后采用银染或同位素放射自显影方法处理序列胶，统计和分析DNA 条带。这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用。MSAP 技术相对其他测定DNA 甲基化程度的技术有如下优点：(1)不需知道被测DNA 的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于DNA 序列背景知识未知的生物。(2)操作相对简便，在AFLP 技术体系的基础无需改进，即可操作。(3)可在全基因组范围检测CCGG 位点的胞嘧啶甲基化变化。MSAP 技术的局限性在于不能完成非CCGG 位点的胞嘧啶甲基化。
1.2 高效液相层析及相关方法
高效液相层析(high performance liquid chromatography, HPLC)能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：先将DNA 样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。Fraga等运用高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis, HPCE)处理DNA水解产物确定5mC 的水平，相比HPLC，HPCE 更简便、快速、经济。HPLC 及HPCE 测定基因组整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。
2. 特定DNA片段甲基化检测方法
2.1 亚硫酸氢盐预处理法
(1)甲基化特异性PCR。甲基化特异性PCR(MSP)是Herman 等首先提出的一种检测基因组DNA 甲基化水平的常用方法。该法是将DNA 经亚硫酸氢钠处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR 反应时，设计两套不同的引物对：一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA 链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA 链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的DNA 序列无互补配对。MSP 引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的CpG 岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中CpG 岛所占比例越高，甲基化DNA 检出率越高。该法不足之处在于：引物的选择和设计非常关键，否则易导致假阳性；如果亚硫酸氢钠对DNA 处理不完全，也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验PCR 产物作进一步判断。
(2)变性高效液相色谱法。Oefner 等提出变性高效液相层析(denaturing HPLC, DHPLC)用于单核苷酸和DNA 分析。邓大君等将该法改进并与PCR 联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法，其原理是将经重亚硫酸氢钠处理的D N A 产物进行差异性扩增，由于原甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理被保留，因此在随后的PCR 扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR 产物在色谱柱中保留的时间明显延长，从而判定出PCR 产物的DNA 序列甲基化状况。
(3)联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法。联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)原理：先对样本DNA行亚硫酸氢钠处理后，PCR 扩增目的片段，随后用限制性内切酶消化，此酶识别序列中需包含CG 序列，如BstUI(CGCG)。若其识别序列中的C 发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR 扩增后保留为CGCG，BstU I 能够识别并进行切割；若待测序列中，C 未发生甲基化，则PCR 后转变为TGTG，BstUI 识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。Brena等联用COBRA和 Agilent 2100 Bioanalyzer对酶切产物进行直接分析，使C O B R A 的定量更快速、准确且无放射性污染。该法的优点是：方法相对简单，不需预先知道CpG 位点及样本序列；可进行甲基化水平的定量研究；需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能；由于酶和PCR 的使用，序列分析受到限制。
1.DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容
D N A 甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。甲基化通常发生在胞嘧啶的C5 位，形成5- 甲基胞嘧啶(5mC)，甲基化的胞嘧啶多位于CpG 岛上。CpG 岛是CpG 二联核苷富集区域，CG含量大于50%，长约200~500 bp。哺乳动物DNA 甲基化的模式只有5mC 这一形式，真核生物中大约2%~7% 的胞嘧啶被甲基化修饰。1. 基因组DNA 甲基化分析方法
早期的基因组DNA 甲基化分析技术，如SssI 甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等，已不能满足现代表观遗传学研究的需求。近年来常用的基因组甲基化分析方法有以下两种。
1.1 甲基化敏感扩增多态性技术
甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术由Reyna-lópez 等报道，并被用于检测双相型真菌的DNA 甲基化，它是在扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技术的基础上建立起来的。
其基本程序是：提取高质量基因组DNA，分别用EcoRI/HpaII，EcoRI/MspI 两组酶组合对基因组DNA 进行双酶切，并连上相应的限制性内切酶的接头，然后以接头序列设计的预扩增引物，进行PCR 扩增。扩增产物稀释后，再加入带有选择性碱基的引物，进行第二次PCR 扩增，扩增产物变性后在6%的序列胶上电泳，最后采用银染或同位素放射自显影方法处理序列胶，统计和分析DNA 条带。这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用。MSAP 技术相对其他测定DNA 甲基化程度的技术有如下优点：(1)不需知道被测DNA 的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于DNA 序列背景知识未知的生物。(2)操作相对简便，在AFLP 技术体系的基础无需改进，即可操作。(3)可在全基因组范围检测CCGG 位点的胞嘧啶甲基化变化。MSAP 技术的局限性在于不能完成非CCGG 位点的胞嘧啶甲基化。
1.2 高效液相层析及相关方法
高效液相层析(high performance liquid chromatography, HPLC)能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：先将DNA 样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。Fraga等运用高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis, HPCE)处理DNA水解产物确定5mC 的水平，相比HPLC，HPCE 更简便、快速、经济。HPLC 及HPCE 测定基因组整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。
2. 特定DNA片段甲基化检测方法
2.1 亚硫酸氢盐预处理法
(1)甲基化特异性PCR。甲基化特异性PCR(MSP)是Herman 等首先提出的一种检测基因组DNA 甲基化水平的常用方法。该法是将DNA 经亚硫酸氢钠处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR 反应时，设计两套不同的引物对：一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA 链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA 链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的DNA 序列无互补配对。MSP 引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的CpG 岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中CpG 岛所占比例越高，甲基化DNA 检出率越高。该法不足之处在于：引物的选择和设计非常关键，否则易导致假阳性；如果亚硫酸氢钠对DNA 处理不完全，也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验PCR 产物作进一步判断。
(2)变性高效液相色谱法。Oefner 等提出变性高效液相层析(denaturing HPLC, DHPLC)用于单核苷酸和DNA 分析。邓大君等将该法改进并与PCR 联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法，其原理是将经重亚硫酸氢钠处理的D N A 产物进行差异性扩增，由于原甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理被保留，因此在随后的PCR 扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR 产物在色谱柱中保留的时间明显延长，从而判定出PCR 产物的DNA 序列甲基化状况。
(3)联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法。联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)原理：先对样本DNA行亚硫酸氢钠处理后，PCR 扩增目的片段，随后用限制性内切酶消化，此酶识别序列中需包含CG 序列，如BstUI(CGCG)。若其识别序列中的C 发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR 扩增后保留为CGCG，BstU I 能够识别并进行切割；若待测序列中，C 未发生甲基化，则PCR 后转变为TGTG，BstUI 识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。Brena等联用COBRA和 Agilent 2100 Bioanalyzer对酶切产物进行直接分析，使C O B R A 的定量更快速、准确且无放射性污染。该法的优点是：方法相对简单，不需预先知道CpG 位点及样本序列；可进行甲基化水平的定量研究；需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能；由于酶和PCR 的使用，序列分析受到限制。
(4)甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法。甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(Ms-SNuPE)可用于快速判断DNA 片段中某些具体位点的甲基化状况。其原理：样本DNA 经亚硫酸氢钠修饰，PCR 扩增目的片段，产物电泳分离后作为Ms-SNuPE 模板。分别针对所检测的CpG 位点设计上游引物，使3'- 端引物紧邻C。然后将模板、引物、Taq 酶及32P 标记的dNTP混合，进行单核苷酸延伸反应。若所检测的CpG 位点发生甲基化，则32P 标记的C 掺入到PCR 产物中；反之，未甲基化掺入的则为T。再电泳分离产物，成像。根据某一CpG 位点的C/T 信号强度比，可定量其甲基化程度。也可不经电泳，PCR 产物直接转移到尼龙膜上，成像后即可得到所测多个CpG 位点的平均甲基化程度。Ms-SNuPE 可快速定量多个CpG位点的甲基化程度，但它不能对较长的序列进行全面的考察，且检测多个CpG 位点时，需设计较多的引物。
2.2 联合甲基化敏感的限制性内切酶法
(1)甲基化敏感的限制性内切酶PCR。甲基化敏感的限制性内切酶PCR(MSRE-PCR)原理为：基因组DNA 经甲基化敏感内切酶广泛消化后，再设计与所选基因特异性匹配的引物，经多重PCR 扩增(未被切割的片段不被识别) ，即可同时、快速检测多基因的D N A 甲基化状态。该法用很小量的DNA 标本即可检测多基因的甲基化状态，且可用于异质性标本，提示其可被进一步发展成为高通量的临床样本分析方法。(2) COMPARE-MS。Yegnasubramanian 等报道了将M B D 柱层析法与甲基化敏感的限制性内切酶法(MS-RE)联用的COMPARE-MS，能快速、敏感地检测DNA 甲基化情况，可用于临床标本检测，作为早期诊断和肿瘤分级的方法学工具。其过程是：用内切酶切取待测片段，再用甲基化敏感的限制性内切酶消化，消化产物经 MBD 柱捕获含有甲基化区的片段，最后通过实时PCR 扩增进行定量分析。这种方法联合运用了M B D 柱层法及M S - R E 法，避免了单用M B D 引起的非特异性捕获及单用内切酶时不完全消化所致的假阳性。此法简便、快速、特异、敏感。缺点是需要使用限制性内切酶，因此不同程度地受到内切酶识别位点的限制。
2.3 探针杂交法
(1)甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法。甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法(MS-MLPA)法是根据 MLPA 技术发展起来的。其原理是：首先，应用MS-MLPA 探针(探针的靶基因识别序列中一定要包含一个甲基化敏感的酶限制位点)和标本DNA 进行杂交使之结合形成DNA- 探针复合物，并用连接酶将探针连接，然后，DNA- 探针复合物与甲基化敏感的限制性内切酶结合并被消化，最后进行PCR 扩增、电泳。如果这个DNA 标本的CpG位点被甲基化，一个MLPA 产物将会被检测到；如果这个位点没有被甲基化，则这个复合物将被消化而不会产生产物。该方法敏感、高效，与目前常用的甲基化检测方法相比具有以下优点：只需要极微量D N A 标本就可以一次检测多种基因的甲基化水平；简便易行，可进行批量检测；M L P A 可以进行定量检测；可用于石蜡包埋标本的检测。
(2) DNA微阵列法。
Yan 等将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于DNA 甲基化检测中，极大的提高了检测的效率。DNA 微阵列, 又称DNA 芯片或基因芯片，是基于杂交的寡核苷酸微阵列法产生的，是一种在基因组中寻找新位点的方法，包括用于整个基因组范围内扫描的差异甲基化(DMH)杂交和用于检测某个位点的甲基化特异性的微阵列( M S O ) 。前者类似于m R N A 表达谱或c D N A 微阵列，是C p G岛微阵列；后者类似于寡核苷酸微阵列，是针对CpG二核苷酸位点的甲基化特异性寡核苷酸微阵列。MSO 要求预先设计一对含有2 个不相邻的GC(或AC)的探针，用于识别甲基化和非甲基化的序列，其中含GC 的探针(5'-GCGC-3')识别甲基化序列，含AC 的探针(5'-ACAC-3' )识别非甲基化序列，探针的5'-端通过Linker 固定于玻璃板上。首先对待研究片段用亚硫酸氢盐处理，将非甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶，甲基化的不变，再行PCR 扩增，产物的3'- 端用荧光素标记，移至连有探针的玻璃板上进行杂交，通过检测杂交后产生的荧光强度判断待测序列中甲基化的水平。此法一定要设立对照，可用于多样本、多位点甲基化的检测，样本需要量少，适于临床样本，但不能得到每个CpG 位点的信息，且探针可能存在交叉杂交，致结果假阳性，影响分析。
虽然人们对D N A 甲基化的研究开展了大量的工作，但缺乏行之有效的甲基化检测方法。随着甲基化研究的不断深入，甲基化分析技术将逐步完善，为表观遗传、胚胎发育、基因印记及肿瘤研究提供强有力的技术支持。
