DNA甲基化分析方法(Methods of DNA methylation analysis)

2010-05-20 02:49 · Lisa

1.DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容 D N A 甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一,它可以在转录水平抑制基因的表达。甲基化通常发生在胞嘧啶的C5 位,形成5- 甲基胞嘧啶(5mC),甲基化的胞嘧啶多位于CpG 岛上。CpG 岛是CpG 二联核苷富集区域,CG含量大于5

1.DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容

D N A 甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一,它可以在转录水平抑制基因的表达。甲基化通常发生在胞嘧啶的C5 位,形成5- 甲基胞嘧啶(5mC),甲基化的胞嘧啶多位于CpG 岛上。CpG 岛是CpG 二联核苷富集区域,CG含量大于50%,长约200~500 bp。哺乳动物DNA 甲基化的模式只有5mC 这一形式,真核生物中大约2%~7% 的胞嘧啶被甲基化修饰。1. 基因组DNA 甲基化分析方法

早期的基因组DNA 甲基化分析技术,如SssI 甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等,已不能满足现代表观遗传学研究的需求。近年来常用的基因组甲基化分析方法有以下两种。

1.1 甲基化敏感扩增多态性技术

甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术由Reyna-lópez 等报道,并被用于检测双相型真菌的DNA 甲基化,它是在扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技术的基础上建立起来的。

其基本程序是:提取高质量基因组DNA,分别用EcoRI/HpaII,EcoRI/MspI 两组酶组合对基因组DNA 进行双酶切,并连上相应的限制性内切酶的接头,然后以接头序列设计的预扩增引物,进行PCR 扩增。扩增产物稀释后,再加入带有选择性碱基的引物,进行第二次PCR 扩增,扩增产物变性后在6%的序列胶上电泳,最后采用银染或同位素放射自显影方法处理序列胶,统计和分析DNA 条带。这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用。MSAP 技术相对其他测定DNA 甲基化程度的技术有如下优点:(1)不需知道被测DNA 的序列信息,在不同生物上具有通用性,可用于DNA 序列背景知识未知的生物。(2)操作相对简便,在AFLP 技术体系的基础无需改进,即可操作。(3)可在全基因组范围检测CCGG 位点的胞嘧啶甲基化变化。MSAP 技术的局限性在于不能完成非CCGG 位点的胞嘧啶甲基化。

1.2 高效液相层析及相关方法

高效液相层析(high performance liquid chromatography, HPLC)能够定量测定基因组整体甲基化水平,其过程是:先将DNA 样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基,水解产物通过色谱柱,将结果与标准品比较,紫外光测定吸收峰值,计算5mC/(5mC+5C)的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。Fraga等运用高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis, HPCE)处理DNA水解产物确定5mC 的水平,相比HPLC,HPCE 更简便、快速、经济。HPLC 及HPCE 测定基因组整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。

2. 特定DNA片段甲基化检测方法

2.1 亚硫酸氢盐预处理法

(1)甲基化特异性PCR。甲基化特异性PCR(MSP)是Herman 等首先提出的一种检测基因组DNA 甲基化水平的常用方法。该法是将DNA 经亚硫酸氢钠处理,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR 反应时,设计两套不同的引物对:一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA 链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化;另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA 链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性,与未经处理的DNA 序列无互补配对。MSP 引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的CpG 岛,以保证引物的特异性,经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点,引物覆盖序列中CpG 岛所占比例越高,甲基化DNA 检出率越高。该法不足之处在于:引物的选择和设计非常关键,否则易导致假阳性;如果亚硫酸氢钠对DNA 处理不完全,也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验PCR 产物作进一步判断。

(2)变性高效液相色谱法。Oefner 等提出变性高效液相层析(denaturing HPLC, DHPLC)用于单核苷酸和DNA 分析。邓大君等将该法改进并与PCR 联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法,其原理是将经重亚硫酸氢钠处理的D N A 产物进行差异性扩增,由于原甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理被保留,因此在随后的PCR 扩增时,其变性温度也相应上升,使PCR 产物在色谱柱中保留的时间明显延长,从而判定出PCR 产物的DNA 序列甲基化状况。

(3)联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法。联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)原理:先对样本DNA行亚硫酸氢钠处理后,PCR 扩增目的片段,随后用限制性内切酶消化,此酶识别序列中需包含CG 序列,如BstUI(CGCG)。若其识别序列中的C 发生完全甲基化(5mCG5mCG),则PCR 扩增后保留为CGCG,BstU I 能够识别并进行切割;若待测序列中,C 未发生甲基化,则PCR 后转变为TGTG,BstUI 识别位点丢失,不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。Brena等联用COBRA和 Agilent 2100 Bioanalyzer对酶切产物进行直接分析,使C O B R A 的定量更快速、准确且无放射性污染。该法的优点是:方法相对简单,不需预先知道CpG 位点及样本序列;可进行甲基化水平的定量研究;需要样本量少,可用于石蜡包埋样本的分析。缺点是:只能获得特殊酶切位点甲基化情况,因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能;由于酶和PCR 的使用,序列分析受到限制。

1.DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容

D N A 甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一,它可以在转录水平抑制基因的表达。甲基化通常发生在胞嘧啶的C5 位,形成5- 甲基胞嘧啶(5mC),甲基化的胞嘧啶多位于CpG 岛上。CpG 岛是CpG 二联核苷富集区域,CG含量大于50%,长约200~500 bp。哺乳动物DNA 甲基化的模式只有5mC 这一形式,真核生物中大约2%~7% 的胞嘧啶被甲基化修饰。1. 基因组DNA 甲基化分析方法

早期的基因组DNA 甲基化分析技术,如SssI 甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等,已不能满足现代表观遗传学研究的需求。近年来常用的基因组甲基化分析方法有以下两种。

1.1 甲基化敏感扩增多态性技术

甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术由Reyna-lópez 等报道,并被用于检测双相型真菌的DNA 甲基化,它是在扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技术的基础上建立起来的。

其基本程序是:提取高质量基因组DNA,分别用EcoRI/HpaII,EcoRI/MspI 两组酶组合对基因组DNA 进行双酶切,并连上相应的限制性内切酶的接头,然后以接头序列设计的预扩增引物,进行PCR 扩增。扩增产物稀释后,再加入带有选择性碱基的引物,进行第二次PCR 扩增,扩增产物变性后在6%的序列胶上电泳,最后采用银染或同位素放射自显影方法处理序列胶,统计和分析DNA 条带。这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用。MSAP 技术相对其他测定DNA 甲基化程度的技术有如下优点:(1)不需知道被测DNA 的序列信息,在不同生物上具有通用性,可用于DNA 序列背景知识未知的生物。(2)操作相对简便,在AFLP 技术体系的基础无需改进,即可操作。(3)可在全基因组范围检测CCGG 位点的胞嘧啶甲基化变化。MSAP 技术的局限性在于不能完成非CCGG 位点的胞嘧啶甲基化。

1.2 高效液相层析及相关方法

高效液相层析(high performance liquid chromatography, HPLC)能够定量测定基因组整体甲基化水平,其过程是:先将DNA 样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基,水解产物通过色谱柱,将结果与标准品比较,紫外光测定吸收峰值,计算5mC/(5mC+5C)的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。Fraga等运用高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis, HPCE)处理DNA水解产物确定5mC 的水平,相比HPLC,HPCE 更简便、快速、经济。HPLC 及HPCE 测定基因组整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。

2. 特定DNA片段甲基化检测方法

2.1 亚硫酸氢盐预处理法

(1)甲基化特异性PCR。甲基化特异性PCR(MSP)是Herman 等首先提出的一种检测基因组DNA 甲基化水平的常用方法。该法是将DNA 经亚硫酸氢钠处理,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR 反应时,设计两套不同的引物对:一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA 链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化;另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA 链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性,与未经处理的DNA 序列无互补配对。MSP 引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的CpG 岛,以保证引物的特异性,经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点,引物覆盖序列中CpG 岛所占比例越高,甲基化DNA 检出率越高。该法不足之处在于:引物的选择和设计非常关键,否则易导致假阳性;如果亚硫酸氢钠对DNA 处理不完全,也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验PCR 产物作进一步判断。

(2)变性高效液相色谱法。Oefner 等提出变性高效液相层析(denaturing HPLC, DHPLC)用于单核苷酸和DNA 分析。邓大君等将该法改进并与PCR 联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法,其原理是将经重亚硫酸氢钠处理的D N A 产物进行差异性扩增,由于原甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理被保留,因此在随后的PCR 扩增时,其变性温度也相应上升,使PCR 产物在色谱柱中保留的时间明显延长,从而判定出PCR 产物的DNA 序列甲基化状况。

(3)联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法。联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)原理:先对样本DNA行亚硫酸氢钠处理后,PCR 扩增目的片段,随后用限制性内切酶消化,此酶识别序列中需包含CG 序列,如BstUI(CGCG)。若其识别序列中的C 发生完全甲基化(5mCG5mCG),则PCR 扩增后保留为CGCG,BstU I 能够识别并进行切割;若待测序列中,C 未发生甲基化,则PCR 后转变为TGTG,BstUI 识别位点丢失,不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。Brena等联用COBRA和 Agilent 2100 Bioanalyzer对酶切产物进行直接分析,使C O B R A 的定量更快速、准确且无放射性污染。该法的优点是:方法相对简单,不需预先知道CpG 位点及样本序列;可进行甲基化水平的定量研究;需要样本量少,可用于石蜡包埋样本的分析。缺点是:只能获得特殊酶切位点甲基化情况,因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能;由于酶和PCR 的使用,序列分析受到限制。

(4)甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法。甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(Ms-SNuPE)可用于快速判断DNA 片段中某些具体位点的甲基化状况。其原理:样本DNA 经亚硫酸氢钠修饰,PCR 扩增目的片段,产物电泳分离后作为Ms-SNuPE 模板。分别针对所检测的CpG 位点设计上游引物,使3'- 端引物紧邻C。然后将模板、引物、Taq 酶及32P 标记的dNTP混合,进行单核苷酸延伸反应。若所检测的CpG 位点发生甲基化,则32P 标记的C 掺入到PCR 产物中;反之,未甲基化掺入的则为T。再电泳分离产物,成像。根据某一CpG 位点的C/T 信号强度比,可定量其甲基化程度。也可不经电泳,PCR 产物直接转移到尼龙膜上,成像后即可得到所测多个CpG 位点的平均甲基化程度。Ms-SNuPE 可快速定量多个CpG位点的甲基化程度,但它不能对较长的序列进行全面的考察,且检测多个CpG 位点时,需设计较多的引物。

2.2 联合甲基化敏感的限制性内切酶法

(1)甲基化敏感的限制性内切酶PCR。甲基化敏感的限制性内切酶PCR(MSRE-PCR)原理为:基因组DNA 经甲基化敏感内切酶广泛消化后,再设计与所选基因特异性匹配的引物,经多重PCR 扩增(未被切割的片段不被识别) ,即可同时、快速检测多基因的D N A 甲基化状态。该法用很小量的DNA 标本即可检测多基因的甲基化状态,且可用于异质性标本,提示其可被进一步发展成为高通量的临床样本分析方法。(2) COMPARE-MS。Yegnasubramanian 等报道了将M B D 柱层析法与甲基化敏感的限制性内切酶法(MS-RE)联用的COMPARE-MS,能快速、敏感地检测DNA 甲基化情况,可用于临床标本检测,作为早期诊断和肿瘤分级的方法学工具。其过程是:用内切酶切取待测片段,再用甲基化敏感的限制性内切酶消化,消化产物经 MBD 柱捕获含有甲基化区的片段,最后通过实时PCR 扩增进行定量分析。这种方法联合运用了M B D 柱层法及M S - R E 法,避免了单用M B D 引起的非特异性捕获及单用内切酶时不完全消化所致的假阳性。此法简便、快速、特异、敏感。缺点是需要使用限制性内切酶,因此不同程度地受到内切酶识别位点的限制。

2.3 探针杂交法

(1)甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法。甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法(MS-MLPA)法是根据 MLPA 技术发展起来的。其原理是:首先,应用MS-MLPA 探针(探针的靶基因识别序列中一定要包含一个甲基化敏感的酶限制位点)和标本DNA 进行杂交使之结合形成DNA- 探针复合物,并用连接酶将探针连接,然后,DNA- 探针复合物与甲基化敏感的限制性内切酶结合并被消化,最后进行PCR 扩增、电泳。如果这个DNA 标本的CpG位点被甲基化,一个MLPA 产物将会被检测到;如果这个位点没有被甲基化,则这个复合物将被消化而不会产生产物。该方法敏感、高效,与目前常用的甲基化检测方法相比具有以下优点:只需要极微量D N A 标本就可以一次检测多种基因的甲基化水平;简便易行,可进行批量检测;M L P A 可以进行定量检测;可用于石蜡包埋标本的检测。

(2) DNA微阵列法。

Yan 等将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于DNA 甲基化检测中,极大的提高了检测的效率。DNA 微阵列, 又称DNA 芯片或基因芯片,是基于杂交的寡核苷酸微阵列法产生的,是一种在基因组中寻找新位点的方法,包括用于整个基因组范围内扫描的差异甲基化(DMH)杂交和用于检测某个位点的甲基化特异性的微阵列( M S O ) 。前者类似于m R N A 表达谱或c D N A 微阵列,是C p G岛微阵列;后者类似于寡核苷酸微阵列,是针对CpG二核苷酸位点的甲基化特异性寡核苷酸微阵列。MSO 要求预先设计一对含有2 个不相邻的GC(或AC)的探针,用于识别甲基化和非甲基化的序列,其中含GC 的探针(5'-GCGC-3')识别甲基化序列,含AC 的探针(5'-ACAC-3' )识别非甲基化序列,探针的5'-端通过Linker 固定于玻璃板上。首先对待研究片段用亚硫酸氢盐处理,将非甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶,甲基化的不变,再行PCR 扩增,产物的3'- 端用荧光素标记,移至连有探针的玻璃板上进行杂交,通过检测杂交后产生的荧光强度判断待测序列中甲基化的水平。此法一定要设立对照,可用于多样本、多位点甲基化的检测,样本需要量少,适于临床样本,但不能得到每个CpG 位点的信息,且探针可能存在交叉杂交,致结果假阳性,影响分析。

虽然人们对D N A 甲基化的研究开展了大量的工作,但缺乏行之有效的甲基化检测方法。随着甲基化研究的不断深入,甲基化分析技术将逐步完善,为表观遗传、胚胎发育、基因印记及肿瘤研究提供强有力的技术支持。

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