陆 嵘，房静远*
（上海交通大学医学院附属仁济医院 上海消化疾病研究所，上海 200001）
摘 要：肿瘤的形成受遗传学修饰和表观遗传修饰的影响。长期以来人们一直认为基因突变参与肿瘤的形成，近年来越来越多的证据表明，表观遗传修饰在肿瘤进展中同样具有非常重要的作用。表观遗传调控可以影响基因转录活性而不涉及DNA 序列的改变。本文介绍了肿瘤发生发展过程中出现的表观遗传修饰异常，以及通过干预表观遗传修饰治疗肿瘤的应用前景。
关键词：肿瘤；表观遗传修饰；DNA 甲基化；组蛋白乙酰化
Epigenetic modification and cancer
LU Rong, FANG Jing-Yuan*
(Shanghai Institute of Digestive Disease, Shanghai Jiaotong University Medical School,
Renji Hospital, Shanghai 200001, China)
Abstract: Carcinogenesis springs from the combined forces of both genetic and epigenetic events. Although the importance of genetic mutations and deletion in cancer have long been recognized, the role of epigenetic modification including DNA methylation and histone modification has been suggested more recently. An epigenetic event alters the activity of genes without changing their structure. This review focuses on the epigenetic molecular mechanisms involved in cancer onset and progression, and discusses the possibility of new strategies in the development of anticancer treatments.
Key words: cancer; epigenetic modification; DNA methylation; histone acetylation
从20 世纪70 年代美国提出攻克癌症计划至今已有三十多年，全球花费大量人力物力，对肿瘤发生发展的机制有了初步的了解，但攻克癌症还任重道远，其根本原因就在于还没有真正认清癌变过程的本质。过去人们一直认为基因突变对肿瘤的形成具有非常重要的作用，并相继发现了许多癌基因和抑制基因。随着研究的不断深入，越来越多的证据向“基因决定论”提出了挑战。例如，同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组，如果这两个孪生子在同样的环境下成长，理论上两人的气质和体质应该非常相似。然而许多孪生子在性格、健康等方面可以有很大的差异，并不符合经典遗传学理论预期的情况，这说明在基因碱基序列没有发生变化的情况下，生物体的表型却发生了改变，从而我们认为包括肿瘤在内许多疾病的形成是一个相当复杂的过程，涉及到各种基因如何响应内外环境的变化，从而实现在时间和空间上表达的调控。近年来遗传学中兴起的一个前沿领域：表观遗传学(Epigenetics) 为人们解答这些问题提供了新思路。
1 表观遗传学说
基因组含有两类遗传信息：一类是传统意义上的遗传信息，即DNA 序列所提供的遗传信息；另一类是表观遗传学信息，它提供了何时、何地、以何种方式去应用遗传信息的指令。早在1942年沃丁顿(Waddington CH)首次提出“Epigenetics”一词，并指出表观遗传与遗传是相对的，主要研究基因型和表型的关系。1987 年，霍利迪(Holiday R)针对 “Epigenetics”作出了更加系统性的论断，即“没有DNA 序列变化的、可遗传的基因表达改变”。
真核细胞的基因组DNA在细胞核里是以染色质形式存在的。染色质的基本结构是核小体，重复的核小体结构加上连接DNA，通过组蛋白及其他非组蛋白蛋白进一步地折叠、压缩形成高度有序的染色质结构。在细胞生命活动的选择性基因沉默或基因表达过程中，包裹于染色质中的基因组DNA序列一般不发生改变，但细胞核内的染色质结构可以发生高度动态变化，使一些特定基因组区域的转录活性呈现相应的改变。这种影响基因转录活性而不涉及 DNA序列改变的基因表达调控方式称为表观遗传调控，其分子基础有两个方面：即针对DNA 本身的修饰和对组蛋白的修饰。研究发现基因沉默或表达在染色质结构上有一定的规律，如DNA甲基化总能在沉默染色质上发现；组蛋白的乙酰化促进基因转录，而去乙酰化抑制基因转录；组蛋白特定氨基酸残基的甲基化可促进基因转录(如H3-K4)或抑制基因转录(如H3-K9、H3-K27)[1]。
2 肿瘤中存在表观遗传修饰的异常
2.1 DNA 甲基化修饰 以DNA 甲基化为代表的表观遗传修饰在肿瘤细胞中经常发生改变[2]。所谓DNA 甲基化是指在DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase, Dnmt)的作用下，以S- 腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5 位碳原子上。 Dnmt1 主要起维持甲基化作用，Dnmt3a 和Dnmt3b 则以从头甲基化为主[3]。多种基因的启动子区和第一外显子富含CpG，而CpG相对集中的区域称之为 CpG 岛。生理情况下，CpG 岛多为非甲基化，大部分散在的CpG二核苷酸则为甲基化状态。细胞分裂复制的DNA子链必须进行适当地甲基化修饰，否则其遗传性不稳定、易变异，其染色体脆性增加、易断裂。
通过对DNA 甲基化模式的研究，人们发现肿瘤细胞中存在异常的DNA 甲基化状态：基因组整体甲基化水平降低，导致遗传不稳定性增加；组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化；癌基因多为不充分甲基化，导致重新开放或异常表达；抑癌基因多为过度甲基化，从而表达受抑制[4]。迄今为止，关于肿瘤抑癌基因的失活与该基因的启动子区域(CpG 岛)的过度甲基化的直接关系有大量的报道。许多与细胞生长增殖相关的基因，如与细胞周期相关的基因pRB、p16、p15、p14ARF 和p73，以及与DNA 损伤修复有关的基因，如O6-MGMT、 BRCA1 和hMLH1 等，它们启动子区域的异常甲基化都与该基因的失活有关[5]。通常使用DNA甲基化酶抑制剂来治疗癌症，其疗效可能是由于这些抑制剂恢复了抑癌基因的活性；但是这种导致DNA 低甲基化的治疗方式，可能在防止一些癌症发生的同时，也会造成基因组的不稳定并增加其他组织罹患癌症的风险。这些都是需要进一步深入研究的问题。
陆 嵘，房静远*
（上海交通大学医学院附属仁济医院 上海消化疾病研究所，上海 200001）
摘 要：肿瘤的形成受遗传学修饰和表观遗传修饰的影响。长期以来人们一直认为基因突变参与肿瘤的形成，近年来越来越多的证据表明，表观遗传修饰在肿瘤进展中同样具有非常重要的作用。表观遗传调控可以影响基因转录活性而不涉及DNA 序列的改变。本文介绍了肿瘤发生发展过程中出现的表观遗传修饰异常，以及通过干预表观遗传修饰治疗肿瘤的应用前景。
关键词：肿瘤；表观遗传修饰；DNA 甲基化；组蛋白乙酰化
Epigenetic modification and cancer
LU Rong, FANG Jing-Yuan*
(Shanghai Institute of Digestive Disease, Shanghai Jiaotong University Medical School,
Renji Hospital, Shanghai 200001, China)
Abstract: Carcinogenesis springs from the combined forces of both genetic and epigenetic events. Although the importance of genetic mutations and deletion in cancer have long been recognized, the role of epigenetic modification including DNA methylation and histone modification has been suggested more recently. An epigenetic event alters the activity of genes without changing their structure. This review focuses on the epigenetic molecular mechanisms involved in cancer onset and progression, and discusses the possibility of new strategies in the development of anticancer treatments.
Key words: cancer; epigenetic modification; DNA methylation; histone acetylation
从20 世纪70 年代美国提出攻克癌症计划至今已有三十多年，全球花费大量人力物力，对肿瘤发生发展的机制有了初步的了解，但攻克癌症还任重道远，其根本原因就在于还没有真正认清癌变过程的本质。过去人们一直认为基因突变对肿瘤的形成具有非常重要的作用，并相继发现了许多癌基因和抑制基因。随着研究的不断深入，越来越多的证据向“基因决定论”提出了挑战。例如，同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组，如果这两个孪生子在同样的环境下成长，理论上两人的气质和体质应该非常相似。然而许多孪生子在性格、健康等方面可以有很大的差异，并不符合经典遗传学理论预期的情况，这说明在基因碱基序列没有发生变化的情况下，生物体的表型却发生了改变，从而我们认为包括肿瘤在内许多疾病的形成是一个相当复杂的过程，涉及到各种基因如何响应内外环境的变化，从而实现在时间和空间上表达的调控。近年来遗传学中兴起的一个前沿领域：表观遗传学(Epigenetics) 为人们解答这些问题提供了新思路。
1 表观遗传学说
基因组含有两类遗传信息：一类是传统意义上的遗传信息，即DNA 序列所提供的遗传信息；另一类是表观遗传学信息，它提供了何时、何地、以何种方式去应用遗传信息的指令。早在1942年沃丁顿(Waddington CH)首次提出“Epigenetics”一词，并指出表观遗传与遗传是相对的，主要研究基因型和表型的关系。1987 年，霍利迪(Holiday R)针对 “Epigenetics”作出了更加系统性的论断，即“没有DNA 序列变化的、可遗传的基因表达改变”。
真核细胞的基因组DNA在细胞核里是以染色质形式存在的。染色质的基本结构是核小体，重复的核小体结构加上连接DNA，通过组蛋白及其他非组蛋白蛋白进一步地折叠、压缩形成高度有序的染色质结构。在细胞生命活动的选择性基因沉默或基因表达过程中，包裹于染色质中的基因组DNA序列一般不发生改变，但细胞核内的染色质结构可以发生高度动态变化，使一些特定基因组区域的转录活性呈现相应的改变。这种影响基因转录活性而不涉及 DNA序列改变的基因表达调控方式称为表观遗传调控，其分子基础有两个方面：即针对DNA 本身的修饰和对组蛋白的修饰。研究发现基因沉默或表达在染色质结构上有一定的规律，如DNA甲基化总能在沉默染色质上发现；组蛋白的乙酰化促进基因转录，而去乙酰化抑制基因转录；组蛋白特定氨基酸残基的甲基化可促进基因转录(如H3-K4)或抑制基因转录(如H3-K9、H3-K27)[1]。
2 肿瘤中存在表观遗传修饰的异常
2.1 DNA 甲基化修饰 以DNA 甲基化为代表的表观遗传修饰在肿瘤细胞中经常发生改变[2]。所谓DNA 甲基化是指在DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase, Dnmt)的作用下，以S- 腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5 位碳原子上。 Dnmt1 主要起维持甲基化作用，Dnmt3a 和Dnmt3b 则以从头甲基化为主[3]。多种基因的启动子区和第一外显子富含CpG，而CpG相对集中的区域称之为 CpG 岛。生理情况下，CpG 岛多为非甲基化，大部分散在的CpG二核苷酸则为甲基化状态。细胞分裂复制的DNA子链必须进行适当地甲基化修饰，否则其遗传性不稳定、易变异，其染色体脆性增加、易断裂。
通过对DNA 甲基化模式的研究，人们发现肿瘤细胞中存在异常的DNA 甲基化状态：基因组整体甲基化水平降低，导致遗传不稳定性增加；组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化；癌基因多为不充分甲基化，导致重新开放或异常表达；抑癌基因多为过度甲基化，从而表达受抑制[4]。迄今为止，关于肿瘤抑癌基因的失活与该基因的启动子区域(CpG 岛)的过度甲基化的直接关系有大量的报道。许多与细胞生长增殖相关的基因，如与细胞周期相关的基因pRB、p16、p15、p14ARF 和p73，以及与DNA 损伤修复有关的基因，如O6-MGMT、 BRCA1 和hMLH1 等，它们启动子区域的异常甲基化都与该基因的失活有关[5]。通常使用DNA甲基化酶抑制剂来治疗癌症，其疗效可能是由于这些抑制剂恢复了抑癌基因的活性；但是这种导致DNA 低甲基化的治疗方式，可能在防止一些癌症发生的同时，也会造成基因组的不稳定并增加其他组织罹患癌症的风险。这些都是需要进一步深入研究的问题。
2.2 组蛋白修饰 组蛋白的修饰比DNA甲基化复杂得多，因为不同组蛋白(组蛋白H3 和H4)的不同氨基酸(H3 末端有7 个Lys 和2 个Ser；H4 末端有5 个 Lys 和1 个Ser)可以发生不同类型的修饰，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP 核糖基化、羰基化等，它们都是组蛋白密码的基本元素[ 6 ]。
在组蛋白的修饰中，研究最多的是乙酰化。乙酰化修饰大多在组蛋白H3 Lys 的9、l4、l8、23 和H4 Lys 5、8、12、l6 等位点。组蛋白乙酰化是可逆的动态过程，组蛋白乙酰基转移酶(histone aceytltransferase，HAT)将乙酰辅酶A(乙酰CoA)乙酰基部分转移到核心组蛋白氨基末端上特定Lys 残基的ε- 氨基基团。氨基上的正电荷被消除，这时 DNA分子本身所带有的负电荷有利于DNA构象的展开，核小体的结构变得松弛。这种松弛的结构促进了转录因子和协同转录因子与DNA分子的接触，因此组蛋白乙酰化可以激活特定基因的转录过程。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)则移去组蛋白Lys 残基上的乙酰基，恢复组蛋白的正电性，带正电荷的Lys 残基与DNA 分子的电性相反，增加了DNA与组蛋白之间的吸引力，使启动子不易接近转录调控元件，从而抑制转录。许多研究已证实了组蛋白高/ 低乙酰化在肿瘤发生中起重要作用。一方面，人们发现，组蛋白乙酰化和脱乙酰化的变化与肿瘤细胞的形态变化有关；另一方面，催化组蛋白乙酰化的HAT(例如p300/CBP、pCAF、ACTR 等)或催化组蛋白脱乙酰化的HDAC可与一些癌基因和抑癌基因产物相互作用，从而修饰或介导这些产物对与细胞分化和细胞增殖有关的基因转录的作用。Yang 等[7]研究了组蛋白低乙酰化在肿瘤发生过程中的作用，证实E1a 原癌蛋白通过干扰p300/CBP 和p/CAF的生长抑制作用而刺激增殖，p300/CBP和 p/CAF 均有HAT活性。另外的研究发现HDAC抑制剂，如丁酸盐和TSA能在体外诱导多种肿瘤细胞系 ( 包括胃癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤、肺癌和白血病等) 的生长停滞、分化或凋亡[ 8]。
在组蛋白的诸多修饰方式中，磷酸化主要影响信号传导通路中相关基因的转录。早在1991 年， Mahadevan 等[9]就发现，组蛋白H3 的快速磷酸化常伴有c-fos 和c-jun 即刻早期(immediate early, IE)反应基因的活化。此后更多的证据表明，组蛋白H3 Ser10磷酸化在真核生物的基因转录活化中起重要作用[10]。ERK- MAPK途径以及p38MAPK途径均能诱导H3 磷酸化。刺激ERK-MAPK 信号传导途径后， c-fos 基因的活化与H3 的磷酸化有关[11]。间接免疫定位研究亦证实，ERK-MAPK信号途径可诱导多个核位点磷酸化组蛋白H3 阳性。其中部分位点的磷酸化H3可能参与了ERK-MAPK信号途径引起的基因快速转录活化[12]。此外H3 Ser10 磷酸化对有丝分裂的启动非常重要，这种修饰发生在G2 期初始阶段，促使染色质凝集[13]。
组蛋白乙酰化和磷酸化都是可逆的。这两种修饰方式的建立和去除对基因转录的影响正好相反。但是组蛋白甲基化一直被人们认为是不可逆的过程，因为组蛋白在特异的组蛋白赖氨酸甲基转移酶的作用下可以进行甲基化修饰，但迄今尚未发现组蛋白脱甲基化酶。组蛋白H3 的5 个Lys(K4、K9、 K27、K36、K79)和H4的1 个Lys(K20)可被甲基化，其中H3-K9、H3-K27、H4-K20 甲基化可以抑制基因表达；而H3-K4、H3-K36、H3-K79 甲基化则具有激活效应[14~15]。组蛋白甲基化和DNA甲基化可联合作用共同参与基因沉默，并通过DNA复制而传递下去。Xin 等[16]认为DNA甲基化是在组蛋白甲基化的下游起作用，而Lehnertz 等[17]则提出了相反的报道。究竟两者中哪一个是基因调控中的起始事件? 或许在不同的生物体或基因中存在相异的答案。
上述各种组蛋白修饰方式都参与了相应基因的活化或抑制，并且这些修饰方式及作用不是独立的，更多的时候可以通过协同或拮抗来发挥作用，例如组蛋白H3 的Lys 既可被乙酰化也可被甲基化，说明两者间存在竞争性修饰，究竟采取何种修饰方式要视具体情况而定。
3 表观遗传学与肿瘤的诊治
不同的人体组织发现，肌肉或者肝脏中的同一种基因，其甲基化模式可以有非常明显的差异。这一研究结果证实了DNA甲基化在不同组织上具有不同模式，这为肿瘤的早期诊断提供了一定的依据。从1999年开始，一些研究者将微阵列技术先后应用于乳腺癌、肺癌和卵巢癌等肿瘤CpG 岛甲基化研究，获得的CpG岛甲基化谱不仅可作为上述肿瘤患者的早期诊断指标，还与肿瘤的病理分型、药物治疗敏感性和预后判断直接相关[18~20]。Schmiemann 等[21]通过甲基化特异性定量PCR(methylation-specific real-time PCR，QMSP)检测发现肺癌患者中存在APC、p16(INK4a)、RASSF1A 等基因的甲基化状态异常，并提出对于早期肺癌的诊断，QMSP 技术是一种高度敏感且普遍实用的辅助方法。此外检测肿瘤DNA 的甲基化模式用于前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌等肿瘤的早期诊断也有相当数量的报道[22~23]。
由于表观遗传机制对肿瘤形成的基本原理的不同，抗肿瘤治疗的策略也存在差异。遗传性的变化是固定的，基因突变是不可逆转的，而表观遗传不影响基因序列，因此肿瘤发生中的DNA甲基化等表观遗传学改变是可以逆转的[24]。目前表观遗传所致的基因失活主要从两个方面进行治疗：抑制DNA甲基化和抑制组蛋白的脱乙酰基作用。
DNA甲基化主要表现为基因组整体甲基化水平降低和局部CpG岛甲基化程度的异常升高，后者可导致某些抑癌基因的表达沉默，进而参与肿瘤的发生发展。在肿瘤或癌前病变中通过去甲基化处理则可以恢复这些基因的表达，从而达到防治肿瘤的目的。特异性地抑制Dnmt 活性，如竞争性底物(发夹式半甲基化寡核苷酸)、核苷类似物(5-aza、5-azadC) 、小分子抑制物(SAH)、反义寡核苷酸等，可使CpG岛甲基化转录失活的抑癌基因恢复功能，如 p14、p15、p16、p21、p53、Rb 等，从而逆转肿瘤细胞生物学活性。5-aza和5-aza-dC可以有效抑制Dnmt 活性，在白血病、骨髓增生异常综合征、非小细胞肺癌等肿瘤中已经取得了很好的疗效[25]。尽管靶向Dnmt 的去甲基化药物取得了可喜的成绩，但仍有一些问题需要解决，如核苷酸类似物的细胞毒性、寡核苷酸在体内或细胞内作用的稳定性与长期疗效等。另外DNA甲基化抑制剂缺乏特异性，可能导致原本处于抑制状态的一些基因恢复活性，这都影响了甲基化抑制剂的临床应用。
自20 世纪90 年代以来，越来越多的HDAC抑制剂被发现和验证。丁酸盐是第一个被验证的 HDAC 抑制剂，已被成功地应用于癌症治疗的实验性研究，并有一定的疗效；另一类应用广泛的抑制剂为氧肟酸类，如TSA和SAHA，它们的特异性较强，所需浓度较低，因此应用较广。HDAC 抑制剂抗肿瘤机制包括阻滞细胞周期和促进细胞分化，诱导细胞凋亡，抑制血管生成等[ 2 6 ]。已有多种 HDAC 抑制剂进行了I 期和II 期临床试验，包括丁酸盐、SAHA、MS-275、CI-994 等。用HDAC 抑制剂对白血病和实体瘤进行治疗，显示了良好的疗效，副作用很少，这说明与传统的化疗药物相比， HDAC 抑制剂具有较大的优势[27]。近年来的研究表明HDAC抑制剂和其他抗肿瘤药物的联合使用具有更加广阔的应用前景。例如联合应用Dnmt 抑制剂和HDAC 抑制剂可以重新激活MLH1、TIMP3、 CDKN2B、CDKN2A 和ARHI 等抑癌基因，促进肿瘤细胞凋亡[28~29]。Shaker 等[30]将TSA 和5-aza-dC 联用治疗白血病，可以减少5-aza-dC 的毒副作用，并达到协同增效作用。HDAC抑制剂与vitamin D 类似物1,25-二羟维生素D联合使用在体外可以促使肿瘤细胞的分化，在体内可以抑制肿瘤的生长[31]。
肿瘤的发生常常涉及多个抑癌基因的失活，针对单一基因的治疗不足以抑制肿瘤生长，甲基化或脱乙酰化酶抑制剂针对的是整个基因组而不是特定的基因，可同时恢复多个抑癌基因的表达，并降低基因突变的发生率，提高基因组稳定性，可能为药物开发提供新的靶点。
4 展望
随着人类基因组计划的完成，生命科学正在阐明遗传信息是如何通过基因的选择性表达，保证生命活动的正常进行和对环境变化的有序应答。人类表观基因组协会(humnan epigenome consortium, HEC) 在2003年10月正式宣布开始实施人类表观基因组计划(human epigenome proiect, HEP)，通过大规模检测人类基因组中的甲基化位点，并确定、分类和解释人类主要组织中所有基因的DNA甲基化模式，绘制人类基因组甲基化可变位点(methylation variable positions, MVP)图谱。这一计划标志着表观遗传学和表观基因组学研究进入一个新的阶段，也为解开生命奥秘及征服肿瘤等疾病带来了希望[32]。
