质粒DNA的提取-碱裂解法

2010-01-25 11:06 · ding

一、实验原理 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤:

①培养细菌,使质粒DNA大量扩增;

②收集和裂解细菌;

③分离和纯化质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们相互缠绕形成不溶性网状结构,而复性的质粒DNA恢复原来构型,保持可溶性状态。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。

二、仪器及试剂

易生物试剂库 https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

易生物仪器库 https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

1.仪器及耗材:37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。

2.试剂及配制:

LB培养液的配制:

酵母浸提物 5.0 g;

胰蛋白胨 10.0 g;

NaCl 10.0 g;

依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解,用5 mol/L NaOH(约0.2 ml)调节培养液的pH值至7.0。再加去离子水将溶液定容至总体积为1000 ml,10磅高压灭菌20 min,冷却后4℃保存。

溶液 Ⅰ(GET缓冲液): 25 mmol/LTris-HCl(pH8.0), 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖

配制:1000 ml

1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 25 ml

0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 20 ml

20% Glucose(1.11mol/L) 45 ml

dH2O 910ml

将以上溶液混合装瓶, 10磅高压灭菌20 min,冷却后4℃保存。

溶液II(变性液):200 mmol/L NaOH , 1% SDS

配制: 500 ml

10% SDS 50 ml

2N NaOH 50 ml

取以上溶液,用灭菌去离子水定容至500 ml,充分混匀。室温保存,此溶液保存时间最好不超过一个月,最好现用现配。

注意:SDS易产生气泡,不要剧烈搅拌。

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤:

①培养细菌,使质粒DNA大量扩增;

②收集和裂解细菌;

③分离和纯化质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们相互缠绕形成不溶性网状结构,而复性的质粒DNA恢复原来构型,保持可溶性状态。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。

二、仪器及试剂

易生物试剂库 https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

易生物仪器库 https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

1.仪器及耗材:37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。

2.试剂及配制:

LB培养液的配制:

酵母浸提物 5.0 g;

胰蛋白胨 10.0 g;

NaCl 10.0 g;

依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解,用5 mol/L NaOH(约0.2 ml)调节培养液的pH值至7.0。再加去离子水将溶液定容至总体积为1000 ml,10磅高压灭菌20 min,冷却后4℃保存。

溶液 Ⅰ(GET缓冲液): 25 mmol/LTris-HCl(pH8.0), 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖

配制:1000 ml

1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 25 ml

0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 20 ml

20% Glucose(1.11mol/L) 45 ml

dH2O 910ml

将以上溶液混合装瓶, 10磅高压灭菌20 min,冷却后4℃保存。

溶液II(变性液):200 mmol/L NaOH , 1% SDS

配制: 500 ml

10% SDS 50 ml

2N NaOH 50 ml

取以上溶液,用灭菌去离子水定容至500 ml,充分混匀。室温保存,此溶液保存时间最好不超过一个月,最好现用现配。

注意:SDS易产生气泡,不要剧烈搅拌。

溶液 III (醋酸钾液):3 mol/L 醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸

配制:500 ml

醋酸钾 147 g

冰醋酸 57.5 ml

加入300 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后,再加去离子水将溶液定容至500 ml。高温高压灭菌后,4℃保存。

10×TE缓冲液(pH 8.0):100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA

配制:1000ml

1 mol/LTris-HCl 缓冲液(pH 8.0) 100ml

500 mmol/L EDTA (pH8.0) 20 ml

加入约800 ml的去离子水,均匀混合。溶液定容至1 L。高温高压灭菌后,4℃保存。

苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1):将量取25 ml Tris-HCl(pH8.0)平衡苯酚,加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇,充分混合后,移入棕色玻璃瓶中,4℃保存。

其它试剂:TE(pH8.0)、异丙醇、氯仿/异戊醇(24:1)、无水乙醇、70%乙醇、氨卞青霉素贮存液(50 mg/ml)

三、操作步骤

1.菌体的培养和收获

(1)将5~10 ml含有氨卞青霉素(AP)的LB培养基加入到容量为100ml的三角瓶中,然后接入一单菌落,并保持通气良好,于37℃ 220 rpm振摇过夜培养(约16h)后可以再转接一次,于37℃ 220 rpm振摇培养3~4 h。

(2)吸取培养的菌液1.5 ml,转入1.5 ml的离心管中,用台式离心机以12000 rpm离心3 min。弃上清,将离心管倒置,使液体尽可能流尽。

2.质粒DNA提取(碱裂解法)

(1)加100 ul 溶液Ⅰ 重悬细菌沉淀,用枪吹打直至混和均匀。

(2)加200 ul溶液 Ⅱ,盖紧管口,轻缓上下颠倒离心管以混合内容物。室温静置5 min(溶液变透明,粘稠)。

(3)加150 ul溶液 Ⅲ,轻微振荡混和10 sec,置冰上10 min (溶液出现白色沉淀)。

(4)12000 rpm离心6 min,取上清液至另一离心管(弃沉淀)。

(5)加等量的酚/氯仿/异戊醇,旋涡混匀1 min,12000 r/min离心6min,取上清液至另一离心管。

(6)加1倍异丙醇,振荡混匀,静置10 min,12000 rpm离心6 min。弃上清液,将离心管倒置于吸水纸,将附于管壁的残余液滴除净。

(7)加200 ul 70%乙醇洗涤沉淀物,台式离心机12000 rpm离心2 min,弃上清液,将沉淀在室温下晾干(或在50℃-60℃的烘箱中也可)。

(8)沉淀加20μl TE, 反复吹打使质粒DNA充分溶解,-20℃保存。

四、常见问题及可能原因

1.提取的质粒DNA不纯:变性不充分;关键步骤反应时间过短;离心时间或速度不够。

2.提取的质粒DNA呈涂布状:操作过程中用力过猛,动作过大;操作系统内有污染。

3.与染色体DNA分离不全:变性过程不完全;试剂配制有问题(成分,浓度或pH)。

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