聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA材料和方法

2010-02-01 11:23 · emma

这种方法最早用Richaed Treisman参照Lis的工作而设计。Lis是最早用聚乙二醇(PEG)分离不同大小DNA的人。Treisman法被广泛用于碱裂解法制备的质粒DNA的纯化。首先将粗提质粒DNA用氯化锂处理沉淀大分子RNA,用RNA酶消化污染的小分子RNA。然后用含P

这种方法最早用Richaed Treisman参照Lis的工作而设计。Lis是最早用聚乙二醇(PEG)分离不同大小DNA的人。Treisman法被广泛用于碱裂解法制备的质粒DNA的纯化。首先将粗提质粒DNA用氯化锂处理沉淀大分子RNA,用RNA酶消化污染的小分子RNA。然后用含PEG的高盐溶液沉淀大的质粒DNA,使短的RNA和DNA片段留在上清中。沉淀下来的质粒DNA用酚:氯仿抽提及乙醇沉淀。这里介绍一种改了的Treisman法:用PEG和MgCl2溶液沉淀质粒DNA。

PEG/ MgCl2 沉淀法与用柱层析和CsCl-溴化乙锭平衡离心纯化质粒DNA的主要区别在于:他不能有效分离带缺口的环状质粒和闭合的环状质粒。后两种方法用于纯化易产生缺口的特大质粒(<15kb)和用于生物物理测量的闭合环状质粒是首选。不过,用PEG/ MgCl2 沉淀法纯化的治理不仅可用于所有分子克隆中的酶学反应(包括DNA测序),还可用于高效转染哺乳动物细胞。

材料

缓冲液和溶液

氯仿乙醇异丙醇LiCl(5mol/L)

PEG- MgCl2 溶液酚:氯仿(1:1,V/V)

乙酸钠(3mol/L,ph5.2)

TE(ph8.0) TE(ph8.0)含20ug/ml Rnase A

核酸和寡核苷酸粗制质粒

离心机和转头

Sorvall-SS34或与其相当的转头

专用设备

冰水浴

易生物仪器库:https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

易生物试剂库:https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

方法

1.用3ml粗提质粒转移到15mlCorex管中,在冰浴中冷却至0℃。

2. 加入3ml冰预冷的5mol/L LiCl,混匀,于4℃离心12000g(Sorvall-SS34转头,10000r/min)10min。

3. 转移上清至30ml Corex管中,加等体积异丙醇,混匀,室温离心回收核酸,12000g(Sorvall-SS34转头,10000r/min)10min。

4. 小心倒去上清,导致管口,使液体流干。室温下用70%乙醇洗沉淀和管壁。小心将乙醇倒去,用真空抽吸器将管壁上残留的乙醇抽干。在纸巾上倒置数分钟,使无可见乙醇残留。但应使沉淀保持湿润。

5. 用500ul含Rnase A的TE(PH8.0)溶解湿润的核酸沉淀。将溶液转移到微量离心管,室温放置30min。

6. 将质粒-Rnase混合物用酚:氯仿抽提一次,然后用氯仿抽提一次。

7. 用标准的乙醇沉淀法回收DNA。

8. 将质粒DNA沉淀用1ml灭菌水溶解,再加入0.5ml PEG- MgCl2 溶液。

9. 室温放置超过10min,然后于室温用微量离心机在最大速度离心20min,以回收沉淀的质粒DNA

10.沉淀用0.5ml70%乙醇重悬以去除微量PEG,用微量离心机在最大速度离心5min以回收核酸。

11.吸去乙醇,重复步骤10.第二次洗涤后,在离心管架上放置10-20min,使乙醇挥发。

12.湿润的质粒沉淀用500ulTE(ph8.0)溶解。以1:100用TE(ph8.0)稀释后测OD260并计算质粒DNA的浓度。按1OD260=50ug质粒DNA/ml计算。

关于DNA的吸光度,。

13.分装DNA并保存于-20℃。

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