【实验目的】
了解从动物组织中提取DNA的原理，掌握DNA定磷法、紫外法、二苯胺法检测及琼脂糖平板电泳操作方法。
【实验原理】
生物体组织细胞中的脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），大部分与蛋白质结合，以核蛋白——脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，这两种复合物在不同的电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。
将抽提得到的DNP用十二烷基硫酸钠（SDS）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入适量的乙醇，DNA即析出，进一步脱水干燥，即得白色纤维状的DNA粗制品。 为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入乙二胺四乙酸 (EDTA)。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可除去。 DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应。
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
对于某些用途（例如用ＢＡＬ31进生活化或用Ｔ４噬菌体多核苷酸激酥标记质粒DNA的限制切片段的５'端），必须获得无RNA污染的DNA制品。通过下述方法，可以从质粒制品中去除RNA。通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析。
【实验流程】
DNA纯度的检测
↗
DNA提取 → DNA纯化 → DNA的分子量的测定→ DNA纯品提取干燥
↓ ↘
DNA的浓度测定 DNA的含量测定
【器材与试剂】
（一）器材
1. 捣碎机 2. 离心机 3. 手术剪 4. 离心管 5. 刻度吸管 6. 烧杯（100ml） 7. 玻棒
8. 新鲜动物肝脏 9.石英比色皿 10.UV-240紫外分光光度计 11.水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；55℃水浴；沸水浴；微量移液器
（二）试剂
（1提取）1. 5mol/L NaCl溶液
NaCl 146.15g溶于蒸馏水稀释到500ml。
2. 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTANa2溶液
NaCl 4.09g及EDTANa2 27.9g溶于蒸馏水稀释到500ml。
3. 25% SDS溶液
SDS 25g溶于45%乙醇100ml中
4. 苯酚氯仿-异丙醇混合液
苯酚：氯仿:异丙醇=25：24:1（V:V）
（2纯化）1.核糖核酸酶A (RNase A)
2.95%乙醇
3.80%乙醇
（3检测）1.二苯胺试剂
二苯胺1.5g溶于100ml冰乙酸,再加浓H2SO4，暗处保存备用，1.5ml,贮于棕色瓶。（临用时配制）
2. 0.5 mol/L过氯酸溶液
将过氯酸（70%）5ml用蒸馏水稀释至55 ml，得1 mol/L过氯酸。将1 mol/L过氯酸25ml用蒸馏水稀释至50 ml，即得0.5 mol/L过氯酸溶液。
（4纯度测定）1.材料：提取的样品 2.试剂：重蒸水，TE缓冲液
（5含量测定）1.二苯胺 2.DNA标准液 3.0.16%乙醛
（6分子量的测定）琼脂糖凝胶电泳 5×TBE电泳缓冲液： 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。
溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10 mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可
【实验目的】
了解从动物组织中提取DNA的原理，掌握DNA定磷法、紫外法、二苯胺法检测及琼脂糖平板电泳操作方法。
【实验原理】
生物体组织细胞中的脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），大部分与蛋白质结合，以核蛋白——脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，这两种复合物在不同的电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。
将抽提得到的DNP用十二烷基硫酸钠（SDS）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入适量的乙醇，DNA即析出，进一步脱水干燥，即得白色纤维状的DNA粗制品。 为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入乙二胺四乙酸 (EDTA)。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可除去。 DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应。
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
对于某些用途（例如用ＢＡＬ31进生活化或用Ｔ４噬菌体多核苷酸激酥标记质粒DNA的限制切片段的５'端），必须获得无RNA污染的DNA制品。通过下述方法，可以从质粒制品中去除RNA。通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析。
【实验流程】
DNA纯度的检测
↗
DNA提取 → DNA纯化 → DNA的分子量的测定→ DNA纯品提取干燥
↓ ↘
DNA的浓度测定 DNA的含量测定
【器材与试剂】
（一）器材
1. 捣碎机 2. 离心机 3. 手术剪 4. 离心管 5. 刻度吸管 6. 烧杯（100ml） 7. 玻棒
8. 新鲜动物肝脏 9.石英比色皿 10.UV-240紫外分光光度计 11.水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；55℃水浴；沸水浴；微量移液器
（二）试剂
（1提取）1. 5mol/L NaCl溶液
NaCl 146.15g溶于蒸馏水稀释到500ml。
2. 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTANa2溶液
NaCl 4.09g及EDTANa2 27.9g溶于蒸馏水稀释到500ml。
3. 25% SDS溶液
SDS 25g溶于45%乙醇100ml中
4. 苯酚氯仿-异丙醇混合液
苯酚：氯仿:异丙醇=25：24:1（V:V）
（2纯化）1.核糖核酸酶A (RNase A)
2.95%乙醇
3.80%乙醇
（3检测）1.二苯胺试剂
二苯胺1.5g溶于100ml冰乙酸,再加浓H2SO4，暗处保存备用，1.5ml,贮于棕色瓶。（临用时配制）
2. 0.5 mol/L过氯酸溶液
将过氯酸（70%）5ml用蒸馏水稀释至55 ml，得1 mol/L过氯酸。将1 mol/L过氯酸25ml用蒸馏水稀释至50 ml，即得0.5 mol/L过氯酸溶液。
（4纯度测定）1.材料：提取的样品 2.试剂：重蒸水，TE缓冲液
（5含量测定）1.二苯胺 2.DNA标准液 3.0.16%乙醛
（6分子量的测定）琼脂糖凝胶电泳 5×TBE电泳缓冲液： 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。
溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10 mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可
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【实验步骤】
（一）DNA的提取
1. 称取新鲜动物的脾（或猪肝、兔肝等）约10g，于研钵中，在冰浴中剪碎，加2倍组织重的冷的0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液（约20ml）研磨成浆状，得匀浆液。
2. 将匀浆液（除去组织碎片）于3000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀（内含DNP），沉淀中加两倍体积的冷的0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，搅匀，如前离心，重复洗涤2～3次。所得沉淀为DNP粗制品，移至烧杯中。
（二）DNA的纯化
1．取粗品DNA
2. 取5ulRNA酶，加入到粗品中，用玻璃棒慢慢搅拌20分钟。
3. 向沉淀中加入冷的0.14mol/LNaCl-0.15mol/L EDTA溶液，使总体积达到20ml，在缓慢搅拌的同时滴加25%的SDS溶液1.5ml，边加边搅拌，此步骤系使核酸与蛋白质分离。
4. 加入5mol/L NaCl溶液5ml，使NaCl最终浓度约为1mol/L，搅拌10min（速度要慢）。溶液变得粘稠并略带透明。
5. 加入等体积的冷的氯仿-异丙醇混合液，于冰浴中搅拌20min，3000rpm离心10min。分层，上层为水相(含DNA钠盐)，中层为变性的蛋白沉淀，下层为氯仿混合液。 （现象附图）
6. 用吸管小心地吸取上层水相，弃去沉淀，再在相同条件下重复抽提2—3次。上清液用于做以下实验。
（三）DNA的检测（用二苯胺法测定DNA）
取上清液2ml加0.5 mol/L过氯酸溶液5ml，室温放置5min，加入二苯胺试剂2ml，于600RC水浴保温 1h，生成蓝色化合物。
（四）DNA的浓度及纯度测定
1. UV-240紫外分光光度计开机预热10min.
2. 用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。
3. 设定狭缝后校零。
4. 将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。
5. 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。
6. 设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。
7. 计算待测样品的浓度与纯度。(纯度=OD260/OD280 纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存)
（五）DNA含量的测定
1、DNA标准曲线的制作
取 6 支洁净干燥试管，编号，按下表加入试剂。
试管编号
试剂（ ml ）
1
2
3
4
5
6
标准 DNA 溶液
（ 200 μ g /ml ）
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
---
标准DNA浓度（μg /ml ）
0
40
80
120
160
200
二苯胺试剂
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
A 595nm
混合后，于100℃水浴中保温15分钟。冷却至室温后，用分光光度计测定吸光值 A 595nm ，以 1 号试管调零，测吸光值。以 DNA 浓度为横坐标， A 595nm 为纵坐标，绘制标准曲线。
2 、样品测定
取 DNA 粗品用 0.05M NaOH 溶解，定容至 50ml 。取 2 支干净干燥的试管，按下表加入试剂，混匀，于100℃水浴中保温15分钟。冷却至室温后，用分光光度计测定吸光值 A 595nm 。以标准曲线的 1 号试管调零，测吸光值。从标准曲线计算样品中 DNA 的含量。
管号
试剂
1
2
3
4
样品液（ ml ）
2
1 . 5
1
0 . 5
蒸馏水 (ml)
0
0 . 5
1
1 . 5
二苯胺试剂
4 . 0
4 . 0
4 . 0
4 . 0
A 595nm
3. 计算结果
DNA%=( 待测液 DNA μg 数 )/ 样品的μg 数× 100%
DNA的分子量的测定 琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
（六）DNA分子量的测定
1.取5×TBE缓冲液20mL加水至200mL，配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。
2.胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
3.胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
4.加样：取10μL DNA样品与2μL 6×上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5.电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，电泳约30min-60min，停止电泳。
6.染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室温下染色5-10min,用清水稍微漂洗。
7.观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。（现象附图）
（七）DNA纯品提取干燥
取剩余上清液放入干燥小烧杯中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。加时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动，随着乙醇的不断加入可见溶液出现粘稠状物质，并能逐步缠绕于玻璃棒上，此时玻璃棒搅动的目的在于把粘稠丝状物缠在玻璃棒上，直至再无粘稠丝状物出现为止。粘稠丝状物即是DNA。
将粘稠的丝状物放置在离心管中，真空冷冻进行干燥得成品。
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DNA实验技术交流论坛：https://bbs.bbioo.com/forum-137-1.html
