实验目的
(1) 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用
(2) 掌握质粒DNA分离、纯化的原理
(3) 学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法
实验原理
质粒(Plasmid)是一种双链的共价闭环状的DNA分子它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构,能够在细胞质中独立自主的进行自身复制,并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看,没有质粒存在,基本上不妨碍细胞的存活,因此质粒是寄生型的自主复制子。根据质粒的这种特性,通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法,使重组到质粒的某种基因(如干扰素基因)带进受体细胞(如具有一定特性的大肠杆菌细胞等)表达它的遗传性质,改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物,或产生新的物质(如干扰素)。目前,质粒已广泛的用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体,同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
遗传工程使用的质粒一般来自细菌,现在发现不仅原核生物,而且真核生物如酵母、天蓝色链霉菌等也存在质粒。在细菌细胞中,质粒DNA通常为染色体DNA的 2%左右,但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内复制,一般分为两种类型:严密控制复制型和松弛控制复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,染色体不复制时,质粒也不复制。每个细胞中只含一个或几个质粒分子,通常大的质粒如F因子等拷贝数少,复制受到严格控制。松弛控制型复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,当染色体复制已经停止时,该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝,一般在20个以上,例如Col E1质粒及其衍生质粒,在每个细胞内约含有20多个拷贝。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素,已达到阻止染色体DNA合成而使细胞内没有蛋白质合成的情况下,由于有关复制所需要的蛋白质的缺少,染色体与严密型质粒的复制都随之停止,但松弛型质粒不受细菌这些复制蛋白的影响,如Col E1质粒或他的衍生质粒仍然继续复制12-16h,直到每个细胞中大约积累1000-2000个拷贝为止。此时质粒DNA含量甚至可达到细胞DNA总量的 40-50%。
性因子(F因子)、抗药因子(R因子)和大肠杆菌素因子等都是常见的质粒。对于带有抗药基因的Col E1衍生质粒,不仅能够大量制备,又便于检出。所以,这种质粒被广泛的使用。质粒pBR322就是Col E1的衍生质粒,它带有抗氨苄青霉素和抗四环素的基因,根据该质粒的抗药性,较容易检出和鉴定。以pBR322为基础,人工构建的pBR322系列质粒以及pUC系列质粒等都是遗传工程中常用的基因运载体。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。
质粒DNA分离纯化方法有多种,但其原理和步骤大同小异,本实验着重介绍两种常用的、快速、微量方法。
1. 碱裂解法
在EDTA存在的条件下,用溶菌酶破坏细菌细胞壁,同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理,使细胞膜崩解,从而达到菌体充分的裂解。此时,细菌染色体 DNA缠绕附着在细胞膜碎片上,离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内,其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA,实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶,可以使它们分解,通过碱性酚(pH8.0)和氯仿-异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质等等。异戊醇的作用是降低表面张力,可以减少抽提过程中产生的泡沫,并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀,获得质粒DNA。
2. 煮沸法
细胞经溶菌酶破壁后,用含有TritonX-100的缓冲液处理,溶解细胞膜。在高温条件下,使蛋白质变性。变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来,质粒 DNA仍留在上清液中。离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理,沉淀出质粒DNA。
以上两种制备方法的实验过程中,由于细菌裂解后受到剪切力或核算降解酶的作用,染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在,因此,采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外,还可能有少部分染色体DNA和RNA,必要时可进一步纯化。
实验目的
(1) 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用
(2) 掌握质粒DNA分离、纯化的原理
(3) 学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法
实验原理
质粒(Plasmid)是一种双链的共价闭环状的DNA分子它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构,能够在细胞质中独立自主的进行自身复制,并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看,没有质粒存在,基本上不妨碍细胞的存活,因此质粒是寄生型的自主复制子。根据质粒的这种特性,通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法,使重组到质粒的某种基因(如干扰素基因)带进受体细胞(如具有一定特性的大肠杆菌细胞等)表达它的遗传性质,改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物,或产生新的物质(如干扰素)。目前,质粒已广泛的用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体,同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
遗传工程使用的质粒一般来自细菌,现在发现不仅原核生物,而且真核生物如酵母、天蓝色链霉菌等也存在质粒。在细菌细胞中,质粒DNA通常为染色体DNA的 2%左右,但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内复制,一般分为两种类型:严密控制复制型和松弛控制复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,染色体不复制时,质粒也不复制。每个细胞中只含一个或几个质粒分子,通常大的质粒如F因子等拷贝数少,复制受到严格控制。松弛控制型复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,当染色体复制已经停止时,该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝,一般在20个以上,例如Col E1质粒及其衍生质粒,在每个细胞内约含有20多个拷贝。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素,已达到阻止染色体DNA合成而使细胞内没有蛋白质合成的情况下,由于有关复制所需要的蛋白质的缺少,染色体与严密型质粒的复制都随之停止,但松弛型质粒不受细菌这些复制蛋白的影响,如Col E1质粒或他的衍生质粒仍然继续复制12-16h,直到每个细胞中大约积累1000-2000个拷贝为止。此时质粒DNA含量甚至可达到细胞DNA总量的 40-50%。
性因子(F因子)、抗药因子(R因子)和大肠杆菌素因子等都是常见的质粒。对于带有抗药基因的Col E1衍生质粒,不仅能够大量制备,又便于检出。所以,这种质粒被广泛的使用。质粒pBR322就是Col E1的衍生质粒,它带有抗氨苄青霉素和抗四环素的基因,根据该质粒的抗药性,较容易检出和鉴定。以pBR322为基础,人工构建的pBR322系列质粒以及pUC系列质粒等都是遗传工程中常用的基因运载体。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。
质粒DNA分离纯化方法有多种,但其原理和步骤大同小异,本实验着重介绍两种常用的、快速、微量方法。
1. 碱裂解法
在EDTA存在的条件下,用溶菌酶破坏细菌细胞壁,同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理,使细胞膜崩解,从而达到菌体充分的裂解。此时,细菌染色体 DNA缠绕附着在细胞膜碎片上,离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内,其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA,实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶,可以使它们分解,通过碱性酚(pH8.0)和氯仿-异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质等等。异戊醇的作用是降低表面张力,可以减少抽提过程中产生的泡沫,并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀,获得质粒DNA。
2. 煮沸法
细胞经溶菌酶破壁后,用含有TritonX-100的缓冲液处理,溶解细胞膜。在高温条件下,使蛋白质变性。变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来,质粒 DNA仍留在上清液中。离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理,沉淀出质粒DNA。
以上两种制备方法的实验过程中,由于细菌裂解后受到剪切力或核算降解酶的作用,染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在,因此,采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外,还可能有少部分染色体DNA和RNA,必要时可进一步纯化。
在嵌合燃料存在的情况下,进行氯化铯密度梯度离心,线状的染色体DNA由于插入较多的染料分子而变的比重较轻,共价闭环质粒DNA插入的染料分子较少,比重较大,从而可以获得高纯度的质粒DNA。
在细胞内,质粒以超螺旋的形式存在于细胞质内,这种DNA分子叫作共价闭环DNA,在一些条件下,如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂,则另一条链就能自由旋转而使分子内的扭曲消除,形成松弛型的分子叫做开环DNA分子,本实验制备出的质粒为cccDNA,但由于较长时间的贮存或操作等原因,会形成部分ocDNA。
本实验制得的质粒DNA经鉴定后可直接用于限制性内切酶降解、细菌转化以及体外重组试验。
试剂和器材
一、试剂
1. LB 液体培养基
胰蛋白胨10g/L,酵母浸膏5g/L,NaCl 10g/L,用NaOH调节至pH7.5,高压灭菌。
2. TEG缓冲液
称取0.3g Tris加入0.1mol/L HCl溶液14.6ml,先配制成pH8.0 Tris-HCl缓冲液100ml,再加入0.37g EDTA-Na2·2H2O和0.99g葡萄糖,临用前加入400mg溶菌酶。
3. 碱裂解液
称取0.8gNaOH和1gSDS定容至100ml
4. 乙酸钾溶液
取60ml5mol/L KAc加入11.5ml冰乙酸和28.5ml蒸馏水
5. 1mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液
Tris 121.14g/L 用盐酸调至pH8.0
6. 酚/氯仿(1:1)溶液配制
(1)将商品苯酚置65℃水浴上缓缓加热融化,取200ml融化酚加入等体积的1mol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液和0.2g (0.1%)8-羟基喹啉,于分液漏斗内剧烈振荡,避光静置使其分项。
(2)弃去上层水相,再用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH8.0与有机相等体积混匀,充分振荡,静置分相,留取有机相。
(3)配制氯仿/异戊醇混合液:将24份氯仿与1份异戊醇混合均匀。
(4)等体积的酚和氯仿/异戊醇溶液混合。放置后,上层若出现水相,可吸出弃去。有机相置棕色瓶内低温保存。
7. TE缓冲液
称取0.12g Tris,加适量蒸馏水溶解,用1mol/L盐酸调至pH8.0并定容至100ml,加入0.037gEDTA·Na2·2H2O。临用前加入核糖核酸酶,为了使RNase制剂中混杂的DNase失活,临用前80℃处理10min
8. STET溶液
称取0.121gTris, 0.037gEDTA·Na2·2H2O溶于80ml蒸馏水,用1mol/L盐酸调pH8.0,并定容至100ml。称取0.584g NaCl 和 5g TritonX-100 用上述溶液溶解后定容至100ml。
9. 溶菌酶溶液
用10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)配制。
10. 2.5mol/L 乙酸钠溶液(pH5.2)
称取34g NaAc·3H2O,溶于80ml水中,用HAc调至pH5.2并定容至1000ml
易生物仪器库:https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库:https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
二、材料
(1) 碱裂解法:携带pBR322质粒的大肠杆菌HB101菌株
(2) 煮沸法:携带质粒的大肠杆菌菌株,如已携带质粒的DH5α菌株
三. 器材:
试管,Eppendorf小离心管,移液器,微量注射器,微孔滤膜细菌滤器,电热恒温水浴,电热恒温培养箱,恒温振荡器,高速台式离心机,沸水浴,冰块,接种环,旋涡混合器。
操作方法
一、 碱裂解法
1. 培养细菌扩增质粒
(1)根据质粒的抗性于3ml LB液体培养基内加入适当的抗菌素
(2)用接种环挑取1个单菌落或吸取少量菌液于含上述双抗LB液体培养基的灭过菌的试管中,37℃,振荡培养12h左右。
2. 收集菌体和裂解细菌
(1)取1.5ml培养液置Eppendorf小离心管内,离心,5000r/min,5min,弃去上清,保留菌体沉淀。如菌量不足可再加入培养液,重复离心,收集菌体。
(2)将菌体沉淀悬浮于预冷的150µL TEG缓冲液内,剧烈振荡、混匀,室温放置10min
(3)加入200µL新鲜配制的碱裂解液,加盖,颠倒数次轻轻混匀,冰上放置5min。
3. 分离纯化质粒DNA
(1)加入150µL冷却的乙酸钾溶液加盖加温和颠倒数次混匀,冰裕放置15min,使沉淀完全。
(2)4℃下离心,12000r/min,5min,乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物,并使过量的SDS-Na+转化为溶解度很低的SDS-K+一起沉淀下来。离心后,上清液若仍混浊,应混匀后再冷至0℃,重复离心。上清液转移至另一干净的Eppendorf管内。
(3)加入等体积的酚/氯仿饱和溶液,反复振荡,离心,12000r/miin, 2min,小心吸取上层水相溶液,转移到另一个Eppendorf管中。
(4)上述溶液中加入两倍体积的预冷无水乙醇,混合摇匀,于冰上放置10min。4℃下离心,12000r/min ,5min, 弃去上清液,并将Eppendorf管倒置在干滤纸上,空干管壁粘附的溶液。
(5)加入70%冷乙醇1ml,洗涤沉淀物,离心,弃去上清液,尽可能除净管壁上的液珠,放置干燥或真空干燥,即得质粒DNA制品。
(6)将DNA沉淀溶于20µLTE缓冲液(临用前加入20µg/mlRNaseA),置-20℃保存。
采用此方法从一个菌落大约能制得2µg以上的质粒DNA,足够供给凝胶电泳以鉴定质粒DNA。
取10µLDNA溶解液加入2µL合适的酶解缓冲液和适量限制性核酸内切酶,37℃保温1-2h后加入2µL终止液,即可用于凝胶电泳分析。
二、 煮沸法
(1)把带有质粒的大肠杆菌1个菌落或少量培养液接种于4mlLB液体培养基,并根据质粒的抗性加入合适的抗菌素,于37℃振荡过夜。
(2)取1.5ml培养液到Eppendorf管中,离心,8000r/min,5min,弃去上清液,倒扣Eppendorf管在干滤纸上,空干溶液。
(3)将菌体重新悬浮于350µL STET缓冲液,加入25µL新配制的溶菌酶溶液。置旋涡混合器上旋转混匀3s
(4)将Eppendorf管放在沸水浴中煮40s(准确)
(5)室温下立即离心,12000r/min,10min,将上清液吸到另一个无菌的Eppendorf管中
(6)于上清液中加入40µL的2.5mol/L乙酸钠溶液和420µL(一倍体积)异戊醇溶液(或加入2-2.5倍体积的95%乙醇,旋涡混合器上混匀后室温放置5min)
(7)在4℃下离心,12000r/min 5min
(8)弃去上清液,DNA沉淀用1ml70%冷乙醇洗涤,同(7)离心,吸去上清液,倒扣离心管于干滤纸上,尽量空干管内液体,室温干燥或真空干燥。
(9)将DNA沉淀溶解在20-50µLTE缓冲液中(临用前加入20µg/ml RNaseA以除去样品中可能存在的DNA),37℃保存10min中后,-20℃保存。
注意事项
(1)实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取,因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。有关细菌培养、保存的方法请查阅微生物有关书籍。
(2)细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌,应使用细菌滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和 Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂经高压灭菌处理。接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。
(3)制备质粒的过程中,所有操作必须暖和,不要剧烈振荡,以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。
(4)加入乙酸钾溶液后,可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物,防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内,不易释放出来。
(5)用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比单独使用更好,为充分除去残余的蛋白质,可以进行多次抽提,直至两相间无絮状蛋白沉淀。
(6)提取的各部操作尽量在低温条件下进行(冰浴上)
(7)为进一步除去残留蛋白质,可将DNA沉淀溶于适量TE缓冲液后,加入等体积酚/氯仿进行多次抽提,离心,吸去水相,再用乙醇沉淀DNA。
(8)沉淀DNA可用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇