一、实验目的
学习与掌握从琼脂糖电泳中回收DNA片段的方法
二、实验原理
对于混合的DNA样品(例如限制性酶切产物等)进行检测和纯化的一种常用方法是进行琼脂糖电泳分析,从电泳后的凝胶中回收出某一DNA带,经过有机溶剂的抽提等一系列纯化过程,便可得到纯化的DNA片段,回收的方法很多,如:电泳洗脱法、冻融挤压法、扩散浸出法、低熔点胶熔化法等,各种方法各有其优点,根据所要回收的DNA分子大小,回收的规模,凝胶的浓度等具体情况选择一种回收方法。
三、实验材料
λDNA的EcoR Ⅰ酶切产物
四、实验仪器、器皿及试剂
仪器、器皿(略)
试剂:低熔点琼脂糖 TE 苯酚 氯仿 EB 无水乙醇 70%乙醇 3mol/lNaAc等
五、实验步骤
1.配制1.0%的琼脂糖凝胶,加入EB至0.5μg/ml
2.加样电泳一段距离,在紫外灯下检测,当DNA片段充分分开后停止电泳。
3.在紫外灯下用小刀在所要回收带前挖一个长方形小洞。
4.将1.0%的熔化的低熔点琼脂糖凝胶(LMA)灌入洞内,凝固后继续电泳。
5.待目的带完全进入LMA后停止电泳,将含目的带的LMA切下装入eppendorf管。
6.加入5倍体积的TE混匀、
7.65℃水浴10min,摇晃,使胶融化。
8.加入等体积的苯酚抽提,10,000r/min离心5min,取上清。
9.加入等体积的氯仿抽提,10,000r/min离心5min,取上清。
10.加入3mol/lNaAc至终浓度为0.2mol/l,用2倍体积的无水乙醇在-20℃沉淀2小时。
11.12,000g离心15min,用70%乙醇洗涤沉淀,真空干燥。
12.溶于适量的TE中,取少量电泳或紫外检测。