重组质粒的抽提

2010-02-28 17:27 · Eileen

一、 实验目的 了解基因工程操作中运载基因的载体,掌握最常用的提取质粒DNA的方法。 二、实验原理 碱变性抽提质粒DNA是根据质粒DNA与染色体DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱(NaOH)及表面活性剂(SDS)使细胞破壁、膜,释放出胞内染色体DNA、

一、 实验目的

了解基因工程操作中运载基因的载体,掌握最常用的提取质粒DNA的方法。

二、实验原理

碱变性抽提质粒DNA是根据质粒DNA与染色体DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱(NaOH)及表面活性剂(SDS)使细胞破壁、膜,释放出胞内染色体DNA、质粒DNA及其它物质。通过一系列的纯化过程:高盐除去核DNA,苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类,然后用乙醇(或异丙醇)沉淀出质粒DNA和RNA等,RNA经RNase消化,得到质粒DNA。这种质粒DNA可用作基因工程的载体,更广泛地用于重组子的鉴定。

三、 实验材料

E.coli

四、 实验仪器、器皿及试剂

仪器、器皿(略)

试剂: 1、溶液1:50mmol/l 葡萄糖

10mmol/l EDTA-Na2

25mmol/l Tris-HCl(pH8.0)

4mmol/l 溶菌酶

2、溶液2:200mmol/l NaOH

1% SDS

3、溶液3:5mol/lKAc 60ml

冰乙酸 11.5ml

ddH2O 28.5ml

4、苯酚-氯仿

5、异丙醇(或95%乙醇,100%乙醇)

6、70%乙醇

7、TE(pH8.0):10mmol/l Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA-Na2

8、RNase1mg/ml Amp100μg/ml

五、 实验步骤

1.挑取一单菌落的E.coli菌种接种到含Amp100μg/ml的LB液体培养基中,37℃震荡培养过夜。

2.吸1.4ml菌液至Eppendorf管中,在高速台式离心机上5000g离心2min,倒去培养基。

3.重复1次,尽可能倒出培养基并将Eppendorf管倒置于吸水纸上,以吸干管壁上残留的培养基,收集细菌。

4.将细菌悬于500μl冰冷的溶液1中,于离心机上5000g离心2min。

5.倒去溶液1,再悬于200μl冰冷的溶液1中,重悬菌液。

6.加入300μl新配制的溶液2,冰浴5min。

7.加入300μl冰冷的溶液3,中和,轻轻震荡10sec,置冰浴5min。

8.于离心机上,12000g离心5min。

9.取600μl上清转移至一新管中。

10.加入等体积的饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1次,10000g离心5min取上清液,转移至一新管。

11.加入1/10体积NaAc溶液(3mol/l),再加入2倍体积的无水乙醇 ,-20℃沉淀20min。

12.10000g离心10min。

13.倒去无水乙醇,用1ml 70%乙醇洗涤沉淀,10000g离心5min。

14.置冰箱内开盖干燥。悬浮至40μl去离子水或TE中。

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