一、 实验目的
了解基因工程操作中运载基因的载体,掌握最常用的提取质粒DNA的方法。
二、实验原理
碱变性抽提质粒DNA是根据质粒DNA与染色体DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱(NaOH)及表面活性剂(SDS)使细胞破壁、膜,释放出胞内染色体DNA、质粒DNA及其它物质。通过一系列的纯化过程:高盐除去核DNA,苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类,然后用乙醇(或异丙醇)沉淀出质粒DNA和RNA等,RNA经RNase消化,得到质粒DNA。这种质粒DNA可用作基因工程的载体,更广泛地用于重组子的鉴定。
三、 实验材料
E.coli
四、 实验仪器、器皿及试剂
仪器、器皿(略)
试剂: 1、溶液1:50mmol/l 葡萄糖
10mmol/l EDTA-Na2
25mmol/l Tris-HCl(pH8.0)
4mmol/l 溶菌酶
2、溶液2:200mmol/l NaOH
1% SDS
3、溶液3:5mol/lKAc 60ml
冰乙酸 11.5ml
ddH2O 28.5ml
4、苯酚-氯仿
5、异丙醇(或95%乙醇,100%乙醇)
6、70%乙醇
7、TE(pH8.0):10mmol/l Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA-Na2
8、RNase1mg/ml Amp100μg/ml
五、 实验步骤
1.挑取一单菌落的E.coli菌种接种到含Amp100μg/ml的LB液体培养基中,37℃震荡培养过夜。
2.吸1.4ml菌液至Eppendorf管中,在高速台式离心机上5000g离心2min,倒去培养基。
3.重复1次,尽可能倒出培养基并将Eppendorf管倒置于吸水纸上,以吸干管壁上残留的培养基,收集细菌。
4.将细菌悬于500μl冰冷的溶液1中,于离心机上5000g离心2min。
5.倒去溶液1,再悬于200μl冰冷的溶液1中,重悬菌液。
6.加入300μl新配制的溶液2,冰浴5min。
7.加入300μl冰冷的溶液3,中和,轻轻震荡10sec,置冰浴5min。
8.于离心机上,12000g离心5min。
9.取600μl上清转移至一新管中。
10.加入等体积的饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1次,10000g离心5min取上清液,转移至一新管。
11.加入1/10体积NaAc溶液(3mol/l),再加入2倍体积的无水乙醇 ,-20℃沉淀20min。
12.10000g离心10min。
13.倒去无水乙醇,用1ml 70%乙醇洗涤沉淀,10000g离心5min。
14.置冰箱内开盖干燥。悬浮至40μl去离子水或TE中。