酵母DNA的提取

2010-03-02 10:14 · Clare

酵母DNA的提取 1. 新鲜的菌体中加入150ul(200ul)bufferiI25(30)ul蜗牛酶(30mg/ml),37度,10Min(可以30min水浴,中间隔5分钟,振荡一次,避免细胞沉到管底。 2. 离心10000rmp,10min,去上清,沉淀中加入buffer

酵母DNA的提取

1. 新鲜的菌体中加入150ul(200ul)bufferiI25(30)ul蜗牛酶(30mg/ml),37度,10Min(可以30min水浴,中间隔5分钟,振荡一次,避免细胞沉到管底。

2. 离心10000rmp,10min,去上清,沉淀中加入bufferII250ul

3. 加入25ul,10%SDS。65度,30min水浴。

4. 加入25ul 5mol/lKAC,冰浴60分钟(4度冰箱放置就可以)

5. 12000rmp,15min,取上清,在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇,混匀放置-20度一小时(可过夜,取出后不要振荡,直接离心)

6. 12000rmp,15min,弃上清。

7. 150ul,bufferIII溶液沉淀,12000rmp,15min

8. 将上清溶液转到干净的离心管中,加入6ul(10ug/ul),Ran酶,37度,30min

9. 加入等体积异丙醇,4度静止10min,10000rmp,5min,溶于50ulbufferIII中

10. 如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提

11. bufferI:0.9mol/l 山梨醇,0.1mol/l EDTA

12. bufferII:50mmol/l Tris,20mmol/l EDTA

13. bufferIII:10mmol/l tris,1mol/l EDTA

14. 筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法

酵母菌落PCR

1. 酵母质粒和基因组DNAPCR模版的制备

取对数生长期酵母菌株1.5ml,13000r/min,离心15s,去上清,双蒸水洗涤一次,13000r/min 离心15s,沉淀悬浮于200ulTE缓冲液中,在沸水上煮1-10min,冰浴10min,13000r/min,离心5min,将上清液储存于-20 度取1ul用于PCR

2. 从平板上调取长势良好的菌落少许,悬浮于含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中(离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔,放置盖子因受热膨胀)水浴煮沸0.2.5.10min

3. 利用微波炉快速制备酵母治理以及菌落取直径大于3mm的酵母干菌落,至于EP管中盖上盖子,在微波炉中加热,加入30ulTE振荡,13000r/min,离心2-5min,上清储存浴-20度,取1ul来作PCR

真菌DNA的提取方法改良

1. 酵母活化后加入YEPD培养基,25-28度培养16-24小时,收集菌体

2. 取少许新鲜的菌体,加入0.6ml缓冲液I(0.9mol/l 山梨醇,0.1mol/l EDTA)1ml。0.1ml蜗牛酶(30mg/ml),37度温浴60min

3. 3000r/min离心10s,去上清,沉淀加入加入bufferII150mmol/l Tris,20mmol/l EDTA 1ml 10%SDS0.1ml65度,30min水浴。

4. 加入0.3ml ,5mol/lKAC冰浴60分钟

5. 10000rmp,15min,取上清,在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇,混匀放置-20度一小时(可过夜,取出后不要振荡,直接离心)在 5000-6000r/min离心15s

6. 沉淀用0.6ml缓冲液III10mmol/l tris,1mol/l EDTA溶解1000r/min,离心15min

7. 上清液转移一个干净的离心管中,加入6ul10ug/ul),Ran酶,37度,30min

8. 加入等体积异丙醇,4度静止10min,10000rmp,5min,溶于50ulbufferIII中

9. 如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提

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