植物基因组DNA提取

2010-03-06 22:53 · amy

原理: 用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品,提取液中的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能螯合金属离子,以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质,从而减少了蛋白质对DNA的污染。然后用CTAB处理,在特定的

原理:

用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品,提取液中的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能螯合金属离子,以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质,从而减少了蛋白质对DNA的污染。然后用CTAB处理,在特定的盐浓度下,CTAB使基因组DNA处于溶解状态,而蛋白质仍为沉淀。经细胞破碎液获得的DNA粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理,其中酚是高效的蛋白变性剂,可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉,然后用氯仿、异戊醇处理,一方面可达到去蛋白的目的,另一方面还可去除残留的酚。

一、材料

植物的根、茎、叶。

二、设备

移液管,高速冷冻离心机,台式离心机,水浴锅。

易生物仪器库:https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

易生物试剂库:https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

三、试剂

1、 CTAB或Nacl溶液:4.1克NaCl溶解于80ml水,缓慢加入10克CTAB,加水至100ml。

2、 其它试剂:氯仿、异戊醇(24:1),酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),异丙醇,TE,10%SDS,蛋白酶K(20mg/ml),5mol/LNaCl。

四、操作步骤

1、 选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干,用蒸馏水洗两次,然后用超纯水洗一遍,吸干,剪碎称0.5-0.25克。

2、 将所取材料放入预冷的研钵(研钵提前要灭菌),研成粉末后置于7ml离心管内(可以换为将样品放置到7ml离心管中800ulCTAB后用玻棒捣碎)。

3、 加入2.4ml 65℃预热的CTAB,充分混合后65℃水浴90min以上,冷却到室温,加入等体积氯仿异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min,取上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀,-20℃度放置20min,4℃离心5000g×5min,去上清。

4、 再沉淀中加入0.6ml的65℃ CTAB温育30min,待沉淀充分溶解,加入等体积氯仿异戊醇充分混匀,4℃离心6000g×5min,去上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻混匀-20℃放置20min。4℃离心5000g×5min,去上清。

5、 用70%乙醇清洗沉淀两次,真空抽干,加入200μl TE溶解DNA后置于4℃备用

6、 提示:

酚、氯仿、异戊醇的作用:

酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白质失去水合状态而变性。变性蛋白质的密度比水的密度大,经过离心与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开,而酚与氯仿有机溶剂比重大,保留在最下层。

作为表面变性剂的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊。酚的变形作用大,但酚与水能有一定程度的互溶,因而损失了这部分水相中的DNA。氯仿的变形作用不如酚效果好,但氯仿不与水相容,不会带走DNA,所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带去。也可以在第二次抽提时将氯仿与酚混合(1:1)使用。

异戊醇能降低分子表面的张力,可以减少抽提过程中的泡沫产生,同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

关键词: