实验原理：
从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法很多。其分离可依据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性提取法，羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、两相法等。其中碱变性法提取效果良好，既经济且收得率较高，提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。
碱变性抽取质粒DNA是基于染色体DNA于质粒DNA的变形与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体的氢键断裂，双螺旋结够解开而变性。质粒DNA的大部分液断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAC高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成的缠连得网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
一、材料
LB培养基上生长的菌落
二、设备
振荡培养箱、微量离心管、台式高速离心机、恒温高速离心机、冰箱、微型电泳槽
易生物仪器库：https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
三、试剂准备
1、溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0）。1M Tris-HCl（pH8.0） 12.5ml，0.5M EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高温高压灭菌15min，贮存于4℃。
2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
3、溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液（pH4.8）。5M Kac 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml、4℃保存备用。
4、TE：10mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA （pH8.0）。1M Tris-HCl（pH8.0）1ml，0.5M EDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）
7、5×TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。
高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml
9、Rnase A（RNA酶 A）：不含DNA酶（Dnase-free）Rnase A的10mg/ml，TE配置，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10、6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11、1% 琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖于三角烧瓶中，加20ml 1×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TAE），即可上样。
实验原理：
从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法很多。其分离可依据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性提取法，羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、两相法等。其中碱变性法提取效果良好，既经济且收得率较高，提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。
碱变性抽取质粒DNA是基于染色体DNA于质粒DNA的变形与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体的氢键断裂，双螺旋结够解开而变性。质粒DNA的大部分液断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAC高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成的缠连得网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
一、材料
LB培养基上生长的菌落
二、设备
振荡培养箱、微量离心管、台式高速离心机、恒温高速离心机、冰箱、微型电泳槽
三、试剂准备
1、溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0）。1M Tris-HCl（pH8.0） 12.5ml，0.5M EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高温高压灭菌15min，贮存于4℃。
2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
3、溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液（pH4.8）。5M Kac 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml、4℃保存备用。
4、TE：10mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA （pH8.0）。1M Tris-HCl（pH8.0）1ml，0.5M EDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）
7、5×TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。
高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml
9、Rnase A（RNA酶 A）：不含DNA酶（Dnase-free）Rnase A的10mg/ml，TE配置，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10、6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11、1% 琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖于三角烧瓶中，加20ml 1×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TAE），即可上样。
四、操作步骤
1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜（约12~14hr）。
2、取1.5ml培养物放入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，将液体尽可能流尽。
3、将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散均匀。
4、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2~3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3~5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6、加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡均匀，4℃离心12000g×10min。
7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2~5min，4℃离心12000g×15min。
8、1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1~2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
提示：
1、实验安排：碱变性法抽提质粒DNA，除了菌体培养、质粒扩增金额和收集菌体外，其提取过程大致可分为三个步骤：从染色体DNA中分离质粒DNA，这是提取过程中最关键的操作步骤;去除质粒DNA中的RNA;进一步纯化质粒DNA，去除蛋白质等杂质。
2、一些试剂的生化作用原理
（1）溶液Ⅰ
溶霉菌：水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。
葡萄糖：增加溶液的粘度，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：金属离子螯合剂，螯合Mg2+，Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子强度作辅基），同时EDTA的存在，有利于溶霉菌的作用。因为溶霉菌的反应要求有较低的离子强度环境。
（2）溶液Ⅱ-NaOH-SDS液
NaOH：核酸在pH值为5~9的溶液中是最稳定的，但pH大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2N，加入提取液时，该系统的pH就会高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：为阴离子表面活性剂，主要功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白SDS蛋白质结合为复合物，使蛋白变性沉淀下来，但SDS能抑制核糖核酸没的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，以防用RNase去除RNA时受到干扰。
（3）溶液Ⅲ-3M KAc（pH4.8）溶液：
KAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸，所以该溶液实际上是KAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的KAc溶液是为了把pH 12.6的抽取液pH调回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol∕L KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷。减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀完全。
（4）为什么用无水乙醇沉淀DNA:
此为实验中最常用的沉淀方法。乙醇的优点是低度极性，可以以任意比例和水相混容，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液时以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合。其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来代替无水乙醇（因无水乙醇价格更贵），但加95%乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中总有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，会影响收得率。折衷的做法是初次沉淀DNA是可用95%乙醇代替无水乙醇，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用异丙醇选择性沉淀DNA，一般在室温下放置15~30min即可。
使用乙醇在低温条件下沉淀DNA，分子运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀，且温度越低，DNA沉淀得越快。
（5）RNase处理核糖核酸后，再次沉淀DNA时为什么一定要加NaAc至最浓度达0.1~0.25M。
在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA纳盐沉淀。当加入大量盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不太好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
（6）为什么将DNA保存于TE缓冲液中？
在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa2=7.2）、硼酸系统（pKal=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围（pH），可以作为DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根将与Ca2+产生沉淀；在DNA酶反应时，不同的煤对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有哦则要求低盐离子浓度，采用Tris-HCL（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲对时Tris+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCL系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
操作要领：
1、该实验成功的标志是把染色体DNA，蛋白质与RNA去除干净。获得一定收得率的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要，也较困难。因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性；又要使染色体DNA不断裂成小片段而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀。摇动时用力适当。一般加入SDS后要注意不能过分用力振荡，但又必须让它反应充分。
2、当加入溶液Ⅱ5min后，若没有看到溶液变稠时，实验不能再继续做下去了。
3、配置试剂时，要用重蒸水配置外，其器皿必须严格清洗，最后要用重蒸水冲洗三次，凡可以进行灭菌的试剂与用具都要经过高压蒸汽灭菌，防止其他杂质或酶对DNA的降解，对Ep管、Tip头与非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50℃温箱中烘干使用。
4、用乙醇沉淀DNA时，要观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可放在冰箱中去沉淀DNA。
