植物DNA的提取(CTAB法)

2010-03-07 14:01 · Sally

实验内容 采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA,并进行纯度分析和琼脂糖凝胶电泳。 目的要求 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。 实验原理 1、原理 核酸是生物有机体中的重要成分,在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核

实验内容

采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA,并进行纯度分析和琼脂糖凝胶电泳。

目的要求

掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。

实验原理

1、原理

核酸是生物有机体中的重要成分,在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类,在真核细胞中,前者主要存在于细胞核中,后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时,通过研磨破坏细胞壁和细胞膜,使核蛋白被释放出来。

在浓氯化钠溶液(1~2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液,就能将蛋白等杂质较彻底地除去,得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA,可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖,在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。

在DNA提取、制备的过程中,核酸极不稳定,许多因素可破坏其完整结构:①化学因素,核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定,pH值在此范围外就会使核酸变性降解,故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素,DNA分子链很长,是双螺旋结构,既有一定的柔性。又有一定的刚性,故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂,不利于收集,应加以避免。③酶的作用,细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来,它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂,同时可使核酸酶被破坏而失活。

2、DNA的提取原理

(1)CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法:先将新鲜的叶片在液氮中研磨,破碎其细胞,然后加入CTAB分离缓冲液,将DNA溶解出来,再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质,最后得到DNA。

(2)SDS法是植物总DNA的提取方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁,然后加入SDS使细胞膜破裂,并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使沉淀更加完全。

3、DNA的浓度测定和纯度分析

(1)定磷法:是对样品中核酸(DNA和RNA)含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸(硫酸或高氯酸)消化成无机磷,然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液,钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物,该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝,在660nm处有最大光吸收。

(2)紫外光吸收法:核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020,1ug/mL的RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相当于50ug/mL的DNA,40ug/mL的RNA。蛋白质的最大吸收在280nm,多糖的最大吸收在230nm。纯的DNA的A260/A280在1.8左右,纯的RNA的A260/A280在2.0左右。

试剂和器材:

(1) 1M Tris-cl(pH8.0)500ml:60.57g Tris,pH8.0

(2) CTAB分离缓冲液

2%CTAB,1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA, 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇共100mL: 2gCTAB,8.18g NaCL,0.74g EDTA.Na2.2H2O,加入10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0),0.2mL巯基乙醇,加水定容到100mL。

(3) 洗涤缓冲液

76%乙醇,10mmol/L乙酸铵共100ml:76mL无水乙醇,0.077g乙酸铵,加水到100mL。

(4) TE缓冲液 10mmol/L Tris-HCL (pH7.4),1mmol/L EDTA

(5) 氯仿-异戊醇(24:1)。

(6) 液氮。

(7) 研钵,恒温水浴(37-100),离心机,离心管。

易生物仪器库:https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

易生物试剂库:https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

操作方法:

(1) 将10mLCTAB分离缓冲液加入50mL离心管中,置于60水浴中预热。

(2) 称取1.5g叶片,置于预冷的研钵中,倒入液氮,尽快将叶片研碎。

(3) 取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中,轻轻转动使之混匀。

(4) 样品于65℃保温30分钟。

(5) 加等体积(10mL)的氯仿-异戊醇,轻轻颠倒混匀。

(6) 室温下4000rpm离心10分钟。

(7) 用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中,加入2/3体积的异丙醇,轻轻混匀,使核酸沉淀下来。(有些情况下,这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链DNA,或者是云雾状的DNA,如果看不到DNA,样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜)。

(8) 用下述方法收集DNA:

如果呈可见的丝状DNA,可用玻璃棒搅起,转移至10-20mL洗涤缓冲液中。

如果DNA呈云雾状,可在2000rpm离心1-2分钟,小心地倒掉上清液,在松散的沉淀

上加10-20mL洗涤缓冲液,轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来。

(9) 洗涤至少20分钟。

(10) 按照(8)法重新收集核酸,并按照(9)法二次洗涤。

(11) 用玻璃棒搅出沉淀或2000rpm离心10分钟。小心倒去上清液,在室温下使DNA沉淀干燥。

(12) 将DNA沉淀溶于1~1.5mLTE中,分装后—20℃保存备用。

(13) 取100uL稀释20倍,测定A260,A280,A230,或作出吸收波谱200~400nm并计算浓度和得率。

(14) 取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳,检查DNA的大小和质量,以λ-DNA/HindⅢ做分子量标准,另取5uL做限制性酶切。

注意;所有操作均须温和,避免剧烈震荡。

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