实验内容
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析和琼脂糖凝胶电泳。
目的要求
掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
实验原理
1、原理
核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中,前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，将其注入两倍体积的95％乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。
2、DNA的提取原理
（1）CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。
（2）SDS法是植物总DNA的提取方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。
3、DNA的浓度测定和纯度分析
（1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。
（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相当于50ug/mL的DNA，40ug/mL的RNA。蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的A260/A280在2.0左右。
试剂和器材：
(1) 1M Tris-cl（pH8.0）500ml：60.57g Tris，pH8.0
(2) CTAB分离缓冲液
2%CTAB，1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA, 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇共100mL： 2gCTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，加入10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0),0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。
(3) 洗涤缓冲液
76%乙醇，10mmol/L乙酸铵共100ml：76mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水到100mL。
(4) TE缓冲液 10mmol/L Tris-HCL （pH7.4），1mmol/L EDTA
(5) 氯仿-异戊醇（24：1）。
(6) 液氮。
(7) 研钵，恒温水浴（37-100），离心机，离心管。
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操作方法：
(1) 将10mLCTAB分离缓冲液加入50mL离心管中，置于60水浴中预热。
(2) 称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。
(3) 取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。
(4) 样品于65℃保温30分钟。
(5) 加等体积（10mL）的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀。
(6) 室温下4000rpm离心10分钟。
(7) 用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。（有些情况下，这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链DNA，或者是云雾状的DNA，如果看不到DNA，样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜）。
(8) 用下述方法收集DNA：
如果呈可见的丝状DNA，可用玻璃棒搅起，转移至10-20mL洗涤缓冲液中。
如果DNA呈云雾状，可在2000rpm离心1-2分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀
上加10-20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来。
(9) 洗涤至少20分钟。
(10) 按照（8）法重新收集核酸，并按照（9）法二次洗涤。
(11) 用玻璃棒搅出沉淀或2000rpm离心10分钟。小心倒去上清液，在室温下使DNA沉淀干燥。
(12) 将DNA沉淀溶于1~1.5mLTE中，分装后—20℃保存备用。
(13) 取100uL稀释20倍，测定A260，A280，A230，或作出吸收波谱200~400nm并计算浓度和得率。
(14) 取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量标准，另取5uL做限制性酶切。
注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
