从大肠杆菌细胞中分离质粒 DNA 的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解法 ( 又称碱变性抽提法 ) 、羟基磷灰石柱层析法、质粒 DNA 释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭 - 氯化铯密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好，经济且收率较高，是一种使用最广泛的制备质粒 DNA 的方法，也是当今分子生物学研究中的常规方法。制备的质粒 DNA 可用于酶切、连接、转化以及 PCR 等。
【原理】
碱裂解分离质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。当细胞在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与染色体 DNA 发生变性，加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒 DNA 又恢复到原来的构型留在上清中，再经酚 / 氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒 DNA 。
质粒 DNA 的存在形式有 3 种：①共价闭环 DNA ，常以超螺旋形式存在；②开环 DNA ，此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性 DNA ，因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度：超螺旋＞线性＞开环。
【试剂】
1.菌种 含 pBR322 或其他质粒 DNA 的大肠杆菌工程菌如 HB101 ， DH5 α， JM109 等，如实验后需直接酶切制备的质粒 DNA ，可选用科研工作中用 Eco R Ⅰ非定向克隆构建的重组质粒 DNA 转化的大肠杆菌，如本实验选用的是实验九制备的 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α。
2. LB 液体培养基 称取胰蛋白胨 3.0g ，酵母提取物 1.5g ， NaCl 3.0g ，加双蒸水 200ml 溶解，用 5mol/L NaOH 调至 pH7.4 ，定容至 300ml ，转移至三角烧瓶中，以 103.4Kpa 高压灭菌 20min 。
3. 10mg/ml 氨苄青霉素 (Amp) 溶液 在无菌条件下配制，－ 20 ℃贮存备用。
4.含 Amp 的 LB 固体培养基 每 100ml LB 培养液在临高压灭菌前加入 1.5g 琼脂，以 103.4KPa 高压灭菌 20min ，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至 50 ℃ ( 用手背碰一下瓶壁不致烫手 ) ，方可加入 Amp ，按每 100ml 培养基加 10mg/ml Amp 溶液 1ml ，使其终浓度为 100 μ g/ml ，然后在超净台上铺平板， 90mm 直径的培养皿约需 25ml 培养基。
5. Tris-HCl 饱和酚 (pH8.0) 将市售的苯酚置于 65 ℃水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至 183 ℃时开始收集于数个棕色瓶中 ( 每瓶约 200ml) ，贮存于－ 20 ℃可保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至 65 ℃水浴融化 ( 冰箱取出后勿立即放入 65 ℃水浴中，以防玻璃炸裂 ) 。融化后加 8- 羟基喹啉至终浓度为 0.1%(w/v) ，溶解混匀，此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的 1mmol/L Tris-HCl(pH8.0) ，立即加盖，剧烈振荡并加入固体 Tris 摇匀 ( 一般加 1g 固体 Tris/100ml 酚 ) 。静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含 0.2% β - 巯基乙醇的 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0) ，剧烈振荡，直至酚相 pH ＞ 7.8 ，将酚装入棕色试剂瓶中，加入 0.1 倍酚体积的含 0.2% β - 巯基乙醇的 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0) 覆盖酚相，置 4 ℃贮存备用。
由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买 Tris-HCl 饱和重蒸酚。
6.溶液Ⅰ 含 50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na 2 ， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ，临用前加溶菌酶至 2mg/ml 。
从大肠杆菌细胞中分离质粒 DNA 的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解法 ( 又称碱变性抽提法 ) 、羟基磷灰石柱层析法、质粒 DNA 释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭 - 氯化铯密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好，经济且收率较高，是一种使用最广泛的制备质粒 DNA 的方法，也是当今分子生物学研究中的常规方法。制备的质粒 DNA 可用于酶切、连接、转化以及 PCR 等。
【原理】
碱裂解分离质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。当细胞在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与染色体 DNA 发生变性，加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒 DNA 又恢复到原来的构型留在上清中，再经酚 / 氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒 DNA 。
质粒 DNA 的存在形式有 3 种：①共价闭环 DNA ，常以超螺旋形式存在；②开环 DNA ，此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性 DNA ，因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度：超螺旋＞线性＞开环。
【试剂】
1.菌种 含 pBR322 或其他质粒 DNA 的大肠杆菌工程菌如 HB101 ， DH5 α， JM109 等，如实验后需直接酶切制备的质粒 DNA ，可选用科研工作中用 Eco R Ⅰ非定向克隆构建的重组质粒 DNA 转化的大肠杆菌，如本实验选用的是实验九制备的 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α。
2. LB 液体培养基 称取胰蛋白胨 3.0g ，酵母提取物 1.5g ， NaCl 3.0g ，加双蒸水 200ml 溶解，用 5mol/L NaOH 调至 pH7.4 ，定容至 300ml ，转移至三角烧瓶中，以 103.4Kpa 高压灭菌 20min 。
3. 10mg/ml 氨苄青霉素 (Amp) 溶液 在无菌条件下配制，－ 20 ℃贮存备用。
4.含 Amp 的 LB 固体培养基 每 100ml LB 培养液在临高压灭菌前加入 1.5g 琼脂，以 103.4KPa 高压灭菌 20min ，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至 50 ℃ ( 用手背碰一下瓶壁不致烫手 ) ，方可加入 Amp ，按每 100ml 培养基加 10mg/ml Amp 溶液 1ml ，使其终浓度为 100 μ g/ml ，然后在超净台上铺平板， 90mm 直径的培养皿约需 25ml 培养基。
5. Tris-HCl 饱和酚 (pH8.0) 将市售的苯酚置于 65 ℃水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至 183 ℃时开始收集于数个棕色瓶中 ( 每瓶约 200ml) ，贮存于－ 20 ℃可保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至 65 ℃水浴融化 ( 冰箱取出后勿立即放入 65 ℃水浴中，以防玻璃炸裂 ) 。融化后加 8- 羟基喹啉至终浓度为 0.1%(w/v) ，溶解混匀，此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的 1mmol/L Tris-HCl(pH8.0) ，立即加盖，剧烈振荡并加入固体 Tris 摇匀 ( 一般加 1g 固体 Tris/100ml 酚 ) 。静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含 0.2% β - 巯基乙醇的 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0) ，剧烈振荡，直至酚相 pH ＞ 7.8 ，将酚装入棕色试剂瓶中，加入 0.1 倍酚体积的含 0.2% β - 巯基乙醇的 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0) 覆盖酚相，置 4 ℃贮存备用。
由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买 Tris-HCl 饱和重蒸酚。
6.溶液Ⅰ 含 50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na 2 ， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ，临用前加溶菌酶至 2mg/ml 。
7.溶液Ⅱ 含 200mmol/L NaOH ， 10g/L SDS ，临用前用两种溶液的贮存液配制。
8.溶液Ⅲ 5mol/L 醋酸钾溶液 60ml( 称取 29.4g 醋酸钾定容至 60ml) ，冰醋酸 11.5ml 和双蒸水 28.5ml 混合而成。
9. 10mg/ml RNase A 称取 RNase A 10mg 溶于 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 、 15mmol/L NaCl 中，于 100 ℃加热煮沸 15min 灭活 DNase ，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－ 20 ℃。如为 Sigma 公司产品，一般则不需加热煮沸。
10. TE 缓冲液 (pH8.0) 含 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0) ， 1mmol/L EDTA-Na 2 (pH8.0) ，以 103.4Kpa 高压蒸汽灭菌， 4 ℃贮存。
11.其他试剂 氯仿、异丙醇、无水乙醇。
【操作步骤】
1.用接种环挑取 1 环冷冻保存的含质粒 DNA 大肠杆菌工程菌（本实验是 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α），划线接种于含有 Amp 的 LB 固体培养基平板上， 37 ℃倒置培养约 12h( 过夜 ) 。
2.用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有 2 ml LB 液体培养基 ( 含 100 μ g/ml Amp) 的试管中， 37 ℃摇荡培养过夜。
3.将菌液收集在 1.5ml 的 EP 管中， 10 000r/min 离心 2min ，弃上清，将离心管倒置于一纸巾上，以使所有液体流出。
4.在沉淀中加入溶液Ⅰ 100 μ l ，涡旋混匀，静置 5min 。
5.加入新鲜配制的溶液Ⅱ 200 μ l ，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴 5 ～ 10min( 溶液变透明，粘稠 ) 。
6.加入溶液Ⅲ 150 μ l ，颠倒混匀，冰浴 5 ～ 10min( 溶液出现白色沉淀 ) 。
7. 12 000r/min 离心 2min ，将上清转移至另一 EP 管中。
8.加等体积酚抽提 1 次， 12 000r/min 离心 2min ，取上层水相转移至另一 EP 管。
9.加等体积氯仿抽提 1 次， 12 000r/min 离心 2min ，取上层水相转移至另一 EP 管。
10.加入 2 倍体积无水乙醇振荡混匀，于室温放置 2min 沉淀 DNA 。 12 000r/min ，离心 5min ，弃乙醇。
11.用 70% 乙醇洗涤沉淀， 12 000r/min ，离心 5min ，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。
12.用 50 μ l 含 RNase A 的 TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀，振荡，室温放置 20min 。 -20 ℃保存。
【注意事项】
1.应先在实验前 2 天划线接种细菌，实验前 1 天晚上进行单菌落液体培养，并注意无菌操作。
2.加入溶液Ⅰ时可用力振荡，而加入溶液Ⅱ 5min 后，如溶液不变粘稠 ( 用移液嘴沾吸没有丝状物出现 ) ，则应终止实验。检查使用的试剂是否正确，加量是否正确。
3.溶液Ⅰ中的溶菌酶宜临用前加入。溶液Ⅱ也应临用前用母液配制。
4.抽提产物经电泳分离、 EB 染色后，在紫外线灯下可观察到三条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒 DNA 。
这里再介绍一种经刘新光等改良的一种简便快速的质粒 DNA 制备方法，可作为今后科研中大量筛选时使用，本内容发表在： 刘新光，刘文，梁念慈 . 一种快速可靠的小量制备质粒 DNA 的方法 . 基础医学与临床， 1998 ， 18(5):396
附： 一种快速可靠的小量制备质粒DNA的方法
小规模快速制备质粒 DNA 是筛选大批重组质粒的阳性克隆的一个不可缺少的步骤，常规经典的方法是碱裂解法。通过该方法制备出来的质粒 DNA 既可进行琼脂糖凝胶电泳，也可进行限制性酶切分析。但该方法在一次筛选数十个克隆时就显得操作步骤烦琐，费时较多。
今介绍一种经我们作了一些改动的快速可靠的小规模制备质粒 DNA 方法，此方法称之为改良一步法。改动后的整个质粒提取操作步骤如下：
1.收获 1.5ml 过夜培养菌液于 1.5ml 微量离心管中，在 12 000r/min 离心 10s 。
2.弃去培养液并尽量吸干 ( 使用微量台式真空泵较方便 ) ，加入 50 μ l TE(pH8.0) 缓冲液，用旋涡混合器振荡以悬浮细胞。
3.用玻璃刻量吸管加入 50 μ l 酚 / 氯仿 (1:1) 混合液，在旋涡混合器上振荡 10s 后，以 12 000 r/min 离心 5min 。
4.小心取出 40 μ l 上清，加入 RNase A 至终浓度 50 μ g/ml ，室温放置 5 min 。
5.取 5 μ l 质粒溶液进行 0.6 ～ 1% 琼脂糖凝胶电泳，并以未重组载体 DNA 作对照， 根据电泳结果即可判断有无外源 DNA 插入。
取适当量可能含重组载体的质粒溶液进行限制性酶切分析。
我们曾用此法一次筛选 72 个克隆，不到 3 小时就得到了质粒 DNA( 包括收集细菌时间 ) ， 5 μ l 质粒 DNA 样品电泳结果很好，重组与非重组质粒 DNA 带十分清晰，重组质粒的进一步酶切分析结果也较好。
