1 目的
掌握用改良CTAB法提取园艺植物总DNA的原理和方法,并分别用核酸蛋白测定仪和凝胶电泳法检测出所提DNA的质量。
2 原理
2.1 DNA提取:CTAB是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在高离子强度的溶液里,CTAB则与蛋白质和大多数酸性多糖以外的多聚糖形成复合物,而不能沉淀核酸。在制备基因组DNA时,CTAB加入调节至高离子强度(>0.7mol/L NaCl)的裂解液中,经过连续的酚和氯仿抽提去除CTAB/黏多糖/蛋白质复合物,用异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可获得基因组DNA。
2.2 分光光度(紫外吸收)法检测DNA质量:DNA的吸收峰在260nm,对于双链DNA,OD260=1.0时溶液浓度为50μg/ml,这样通过用紫外分光光度计测定所提DNA溶液在260nm的吸光值,可以计算出所提DNA的浓度,计算公式为:DNA样品浓度(μg/μl)= OD260×N(样品稀释倍数)×50/1000。而蛋白质的吸收峰在280nm,核苷酸等小分子量物质的吸收峰在230nm,这样通过测定OD280和 OD230的吸光值,计算出OD260/ OD280及OD260/ OD230的比值后,可以判断所提DNA的纯度:纯的DNA溶液其OD260/ OD280应为1.8,OD260/ OD230应大于2.0。OD260/ OD280大于1.9时,表明有RNA污染;小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260/ OD230小于2.0时,表明溶液中有残存的盐和小分子杂质,如核苷酸、氨基酸、酚等。
2.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量:琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应和分子筛效应。不同DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子,在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上,且荧光强度与DNA含量成正比。用肉眼观察,可检测到5ng以上的DNA。
3 实验材料
每个学生做1个老师已经准备的幼嫩、健康的园艺植物材料。
4 仪器设备
高速冷冻离心机(Ependorf Centrifuge 5810R)、高速台式离心机(Ependorf Centrifuge 5415D)、电泳装置(包括BIO-RAD Sub-Cell 192电泳槽和PAC300电泳仪)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、Biophotometer核酸蛋白测定仪、MicroBio Mixer Genius、液氮罐、振荡器、电子天平、恒温水浴锅、烘箱、微波炉等。
5 实验用具
2ml离心管(3只/个材料)、1.5ml离心管(3只/个材料)、研钵(每人1套)、小剪刀、棉纱手套、不锈钢药匙、2ml离心管架、1.5ml离心管盒、吸耳球、1ml移液枪、1ml吸头、1ml吸头盒、100μl移液枪、200μl 吸头、200μl 吸头盒、10μl移液枪、10μl 吸头、10μl 吸头盒、冰盒、各种规格的试剂瓶若干个。
6 试剂
液氮、2 × CTAB 提取液【CTAB 2%,Tris-HCL(pH8.0 ) 100mmol/L,EDTA (pH8.0) 20mmol/L,NaCL 1.4 mol/L,PVP 1%(w/v),ME(巯基乙醇) 0.1%(v/v) 用时现加】,氯仿/异戊醇(24 :1),无水乙醇,70%乙醇,异丙醇,RNA酶,TE或双蒸水
7 实验步骤
(1) 在所需量的2 × CTAB提取液中加入0.1%巯基乙醇(ME);
(2) 取0.5~1g材料,加液氮磨成粉,将磨好的材料转入2ml的离心管中,加1ml CTAB提取液,充分混匀,置于65℃水浴60min,期间不断摇动;
(3) 冷至室温,加入等体积的氯仿/异戊醇(24 :1),轻轻摇动至溶液成乳化状,10000rpm,离心5min;
(4) 取上清液,重复(3)步1次;
(5) 取上清液,加入2/3体积的异丙醇,-20℃放置30min;
(6) 10000rpm,离心5min,弃上清液,用70%乙醇洗沉淀2-3次;
(7) 加入灭菌TE或双蒸水溶液溶解沉淀,加入1/10体积NaAC(3mol/L)和2倍体积无水乙醇,-20℃放置2hr以上;
(8) 12000rpm离心5min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2-3次,室温干燥沉淀;
(9) 用50-100ul灭菌0.1%TE或双蒸水溶解沉淀,即为所需的DNA样品,未用部分,-20℃保存。
(10)Biophotometer核酸蛋白测定仪分析:取15μl DNA样品稀释20倍,在Biophotometer核酸蛋白测定仪上测定A260、A280和A230值,记录所测结果,判定所提DNA的浓度和纯度。
(11)、琼脂糖凝胶电泳分析:用0.8%的凝胶【老师已经做好】,点4μl所提的样品,电泳检测精制DNA质量,估算出浓度。