1 目的
掌握用改良CTAB法提取园艺植物总DNA的原理和方法，并分别用核酸蛋白测定仪和凝胶电泳法检测出所提DNA的质量。
2 原理
2.1 DNA提取：CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在高离子强度的溶液里，CTAB则与蛋白质和大多数酸性多糖以外的多聚糖形成复合物，而不能沉淀核酸。在制备基因组DNA时，CTAB加入调节至高离子强度（＞0.7mol/L NaCl）的裂解液中，经过连续的酚和氯仿抽提去除CTAB/黏多糖/蛋白质复合物，用异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可获得基因组DNA。
2.2 分光光度（紫外吸收）法检测DNA质量：DNA的吸收峰在260nm，对于双链DNA，OD260=1.0时溶液浓度为50μg/ml，这样通过用紫外分光光度计测定所提DNA溶液在260nm的吸光值，可以计算出所提DNA的浓度，计算公式为：DNA样品浓度（μg/μl）= OD260×N（样品稀释倍数）×50/1000。而蛋白质的吸收峰在280nm，核苷酸等小分子量物质的吸收峰在230nm，这样通过测定OD280和 OD230的吸光值，计算出OD260/ OD280及OD260/ OD230的比值后，可以判断所提DNA的纯度：纯的DNA溶液其OD260/ OD280应为1.8，OD260/ OD230应大于2.0。OD260/ OD280大于1.9时，表明有RNA污染；小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260/ OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。
2.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。
3 实验材料
每个学生做1个老师已经准备的幼嫩、健康的园艺植物材料。
4 仪器设备
高速冷冻离心机（Ependorf Centrifuge 5810R）、高速台式离心机（Ependorf Centrifuge 5415D）、电泳装置（包括BIO-RAD Sub-Cell 192电泳槽和PAC300电泳仪）、凝胶成像系统（BIO-RAD）、Biophotometer核酸蛋白测定仪、MicroBio Mixer Genius、液氮罐、振荡器、电子天平、恒温水浴锅、烘箱、微波炉等。
5 实验用具
2ml离心管（3只/个材料）、1.5ml离心管（3只/个材料）、研钵（每人1套）、小剪刀、棉纱手套、不锈钢药匙、2ml离心管架、1.5ml离心管盒、吸耳球、1ml移液枪、1ml吸头、1ml吸头盒、100μl移液枪、200μl 吸头、200μl 吸头盒、10μl移液枪、10μl 吸头、10μl 吸头盒、冰盒、各种规格的试剂瓶若干个。
6 试剂
液氮、2 × CTAB 提取液【CTAB 2%，Tris-HCL(pH8.0 ) 100mmol/L，EDTA (pH8.0) 20mmol/L，NaCL 1.4 mol/L，PVP 1%(w/v)，ME（巯基乙醇） 0.1%(v/v) 用时现加】，氯仿/异戊醇（24 ：1），无水乙醇，70%乙醇，异丙醇，RNA酶，TE或双蒸水
7 实验步骤
（1） 在所需量的2 × CTAB提取液中加入0.1%巯基乙醇（ME）；
（2） 取0.5～1g材料，加液氮磨成粉，将磨好的材料转入2ml的离心管中，加1ml CTAB提取液，充分混匀，置于65℃水浴60min，期间不断摇动；
（3） 冷至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24 ：1），轻轻摇动至溶液成乳化状，10000rpm，离心5min；
（4） 取上清液，重复（3）步1次；
（5） 取上清液，加入2/3体积的异丙醇，-20℃放置30min；
（6） 10000rpm，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗沉淀2-3次；
（7） 加入灭菌TE或双蒸水溶液溶解沉淀，加入1/10体积NaAC（3mol/L）和2倍体积无水乙醇，-20℃放置2hr以上；
（8） 12000rpm离心5min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2-3次，室温干燥沉淀；
（9） 用50-100ul灭菌0.1%TE或双蒸水溶解沉淀，即为所需的DNA样品，未用部分，-20℃保存。
（10）Biophotometer核酸蛋白测定仪分析：取15μl DNA样品稀释20倍，在Biophotometer核酸蛋白测定仪上测定A260、A280和A230值，记录所测结果，判定所提DNA的浓度和纯度。
（11）、琼脂糖凝胶电泳分析：用0.8％的凝胶【老师已经做好】，点4μl所提的样品，电泳检测精制DNA质量，估算出浓度。
