【原理】
碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。当细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒DNA又恢复到原来的构型留在上清中，再经酚/氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒DNA。
质粒DNA的存在形式有3种：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒DNA的3种形式泳动速度：超螺旋＞线性＞开环。
限制性内切酶(restrictionendonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成RE酶切位点的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。
本实验是将GFP重组质粒DNA作为KpnⅠ与ApaI酶切底物。T-GFP重组质粒用KpnⅠ酶切则应得到线性GFP重组质粒（3.7kb）；KpnⅠ与ApaI双酶切应得线性空载T载体(3.0kb)和GFPcDNA(0.73kb)两个片段。经琼脂糖凝胶电泳后可较容易鉴定鉴定该质粒中的插入片段。
【试剂】
1.菌种：含绿色荧光蛋白重组子或其他质粒DNA的大肠杆菌工程菌如HB101，DH5α，JM109等，如实验后需直接酶切制备的质粒DNA，可选用科研工作中用EcoRⅠ非定向克隆构建的重组质粒DNA转化的大肠杆菌，如本实验先用的是实验二制备的含GFP重组质粒的DH5α。
2.LB液体培养基：称取胰蛋白胨3.0g，酵母提取物1.5g，NaCl3.0g，加双蒸水200ml溶解，用5mol/LNaOH调至pH7.4，定容至300ml，转移至三角烧瓶中，以103.4Kpa高压灭菌20min。
3.10mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液：在无菌条件下配制，－20℃贮存备用。
4.含Amp的LB固体培养基：每100mlLB培养液在临高压灭菌前加入1.5g琼脂，以103.4KPa高压灭菌20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至50℃(用手背碰一下瓶壁不致烫手)，方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/mlAmp溶液1ml，使其终浓度为100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm直径的培养皿约需25ml培养基。
5.Tris-HCl饱和酚(pH8.0)：将市售的苯酚置于65℃水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至183℃时开始收集于数个棕色瓶中(每瓶约200ml)，贮存于－20℃可保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至65℃水浴融化(冰箱取出后勿立即放入65℃水浴中，以防玻璃炸裂)。融化后加8-羟基喹啉至终浓度为0.1%(w/v)，溶解混匀，此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的1mmol/LTris-HCl(pH8.0)，立即加盖，剧烈振荡并加入固体Tris摇匀(一般加1g固体Tris/100ml酚)。静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，剧烈振荡，直至酚相pH＞7.8，将酚装入棕色试剂瓶中，加入0.1倍酚体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)覆盖酚相，置4℃贮存备用。
由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买Tris-HCl饱和重蒸酚。
6.溶液Ⅰ：含50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na2，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，临用前加溶菌酶至2mg/ml。
7.溶液Ⅱ：含200mmol/LNaOH，10g/LSDS，临用前用两种溶液的贮存液配制。
8.溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾溶液60ml(称取29.4g醋酸钾定容至60ml)，冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml混合而成。
9.10mg/mlRNaseA：称取RNaseA10mg溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，于100℃加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃。如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸。
【原理】
碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。当细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒DNA又恢复到原来的构型留在上清中，再经酚/氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒DNA。
质粒DNA的存在形式有3种：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒DNA的3种形式泳动速度：超螺旋＞线性＞开环。
限制性内切酶(restrictionendonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成RE酶切位点的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。
本实验是将GFP重组质粒DNA作为KpnⅠ与ApaI酶切底物。T-GFP重组质粒用KpnⅠ酶切则应得到线性GFP重组质粒（3.7kb）；KpnⅠ与ApaI双酶切应得线性空载T载体(3.0kb)和GFPcDNA(0.73kb)两个片段。经琼脂糖凝胶电泳后可较容易鉴定鉴定该质粒中的插入片段。
【试剂】
1.菌种：含绿色荧光蛋白重组子或其他质粒DNA的大肠杆菌工程菌如HB101，DH5α，JM109等，如实验后需直接酶切制备的质粒DNA，可选用科研工作中用EcoRⅠ非定向克隆构建的重组质粒DNA转化的大肠杆菌，如本实验先用的是实验二制备的含GFP重组质粒的DH5α。
2.LB液体培养基：称取胰蛋白胨3.0g，酵母提取物1.5g，NaCl3.0g，加双蒸水200ml溶解，用5mol/LNaOH调至pH7.4，定容至300ml，转移至三角烧瓶中，以103.4Kpa高压灭菌20min。
3.10mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液：在无菌条件下配制，－20℃贮存备用。
4.含Amp的LB固体培养基：每100mlLB培养液在临高压灭菌前加入1.5g琼脂，以103.4KPa高压灭菌20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至50℃(用手背碰一下瓶壁不致烫手)，方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/mlAmp溶液1ml，使其终浓度为100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm直径的培养皿约需25ml培养基。
5.Tris-HCl饱和酚(pH8.0)：将市售的苯酚置于65℃水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至183℃时开始收集于数个棕色瓶中(每瓶约200ml)，贮存于－20℃可保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至65℃水浴融化(冰箱取出后勿立即放入65℃水浴中，以防玻璃炸裂)。融化后加8-羟基喹啉至终浓度为0.1%(w/v)，溶解混匀，此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的1mmol/LTris-HCl(pH8.0)，立即加盖，剧烈振荡并加入固体Tris摇匀(一般加1g固体Tris/100ml酚)。静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，剧烈振荡，直至酚相pH＞7.8，将酚装入棕色试剂瓶中，加入0.1倍酚体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)覆盖酚相，置4℃贮存备用。
由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买Tris-HCl饱和重蒸酚。
6.溶液Ⅰ：含50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na2，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，临用前加溶菌酶至2mg/ml。
7.溶液Ⅱ：含200mmol/LNaOH，10g/LSDS，临用前用两种溶液的贮存液配制。
8.溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾溶液60ml(称取29.4g醋酸钾定容至60ml)，冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml混合而成。
9.10mg/mlRNaseA：称取RNaseA10mg溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，于100℃加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃。如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸。
10.TE缓冲液(pH8.0)：含10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)，以103.4Kpa高压蒸汽灭菌，4℃贮存。
11.限制性内切酶KpnⅠ和ApaI及其缓冲液只需购买国内试剂公司的产品即可，每种RE均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该RE均可获得100%酶切活性。
12.50×TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml。1×TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。
13.溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液)称取溴酚蓝100mg，加双蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50ml，加入NaOH1滴，调至蓝色。
14.溴化乙锭(EB，1mg/ml)戴手套谨慎称取EB20mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每100ml凝胶加50μlEB。
15.DNA分子量标准根据需要购买，一般浓度为0.5μg/μl。
16.其他试剂：氯仿、异丙醇、无水乙醇。
【操作步骤】
1.用接种环挑取1环冷冻保存的含质粒DNA大肠杆菌工程菌（本实验是含GFP重组质粒的DH5α），划线接种于含有Amp的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养约12h(过夜)。
2.用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有2mlLB液体培养基(含100μg/mlAmp)的试管中，37℃摇荡培养过夜。
3.将菌液收集在1.5ml的EP管中，10000r/min离心2min，弃上清，将离心管倒置于一纸巾上，以使所有液体流出。
4.在沉淀中加入溶液Ⅰ100μl，涡旋混匀，静置5min。
5.加入新鲜配制的溶液Ⅱ200μl，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴5～10min(溶液变透明，粘稠)。
6.加入溶液Ⅲ150μl，颠倒混匀，冰浴5～10min(溶液出现白色沉淀)。
7.12000r/min离心2min，将上清转移至另一EP管中。
8.加等体积酚抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。
9.加等体积氯仿抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。
10.加入2倍体积无水乙醇振荡混匀，于室温放置2min沉淀DNA。12000r/min，离心5min，弃乙醇。
11.用70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心5min，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。
12.用50μl含RNaseA的TE缓冲液溶解DNA沉淀，振荡，室温放置20min。-20℃保存。
13.将下列试剂缓冲液2μl，λDNA(5μg)或基因组DNA(5μg)或质粒DNA样品(1μg)，KpnⅠ和ApaI各5～10U加至0.5mlEP管中，加双蒸水至20μl，加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应1h。
14.制备琼脂糖凝胶在进行酶切时预先灌好.称取1g琼脂糖，加2ml50×TAE电泳Buffer和98ml蒸馏水，在电炉或微波炉上溶解，配制成1%琼脂糖凝胶100ml，稍冷后，加5μl10mg/mlEB，混匀.安装好电泳槽和样品梳，灌胶。
15.上样在电泳槽内盛放1×TAE，撕去制胶托架两端的封胶，将制胶托架装入电泳槽内，小心取出样品梳.取PCR样品10μl，加2μl6×载样buffer在Parafilm膜上混匀，上样。
16.电泳正确连接电极，在100V恒压条件进行电泳，待蓝色染料泳过2/3段凝胶，停止电泳。
17.取出凝胶，在紫外分析仪上观察结果，分析判断酶切产物的大小。
