基本概念：
总DNA（total DNA, genomic DNA）凝胶电泳
[实验目的]
1.学习细菌总DNA提取的原理和方法
2. 学习琼脂糖凝胶电泳方法
[实验材料]
1.菌种
自己分离纯化后的细菌菌株
2.试剂
TE、溶菌酶溶液（20mg/ml）、10% SDS、蛋白酶K（20mg/ml）、5mol/L NaCl酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、乙醇
3. 仪器
高速台式离心机、紫外检测仪
4. 其他材料：离心管、无菌吸头、移液器等
[实验步骤和过程]
（一）细菌总DNAD 提取
革兰氏阳性菌DNA提取方法(提取基因组DNA)
1. 3-6ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 弃上清
2. 加0.5ml TE悬浮沉淀,并加75μl 溶菌酶（20mg/ml）溶液，40°C保温30分钟
3. 加50μl, 10% SDS, 5μl 蛋白酶K （20mg/ml）,混匀, 37℃保温30分钟
4. 加0.75ml, 5mol/L NaCl, 混匀
5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 静置10分钟，5000转离心10分钟，转移上清到干净管中。
7. 加2倍体积乙醇沉淀DNA, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，离心沉淀DNA
8. 70%乙醇漂洗DNA后, 吸干, 用30-50μl TE溶解DNA, -20℃保存
革兰氏阴性菌总DNA提取方法
方法一：
1. 将菌液悬于1.5ml溶菌酶溶液（0.15mol/l Nacl, 0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8）.
2. 37℃温浴2h，
3. 加入1.5ml 10%SDS（0.1mol/l Nacl，0.5mol/l Tris，10%SDS，pH=8）反复颠倒混匀10min，10000r/min离心10min，取上清
4. 用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加入40μl的3mol/l乙酸铵和3ml无水乙醇，-20℃沉淀DNA1h，12000r/min 离心10min
5. 收集DNA沉淀，用100μl TE溶解
方法二：
1. 加入DNA提取液100 mmol/l，（Tris100 mmol/lEDTA，100 mmol/lNacl，1%pvp , 2%SDS，pH=8）旋涡混匀
2. 在摇床上250 r/min振荡2h，4℃沉淀DNA 1 h，13000 r/min离心10min收集DNA 沉淀
3. 用100μlTE溶解DNA
方法三：
1.加入DNA提取液（100 mmol/l，Tris100 mmol/lEDTA，100 mmol/l磷酸钠，1.5mol/l Nacl，1%CTAB，pH=8），20μl蛋白酶K（20mg/ml）和500μl溶菌酶（0.15mol/l Nacl,0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8），37℃温浴2h。
2.加入1 ml 20%SDS，65℃水浴过夜
3.加入1/3倍体积饱和Nacl,剧烈振荡，12000 r/min 离心10min
4.取上清，用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加入等体积TE，再加入0.6倍体积的异丙醇室温沉淀DNA 2h
5.12000 r/min 离心10min收集DNA沉淀，用200μlTE溶解
基本概念：
总DNA（total DNA, genomic DNA）凝胶电泳
[实验目的]
1.学习细菌总DNA提取的原理和方法
2. 学习琼脂糖凝胶电泳方法
[实验材料]
1.菌种
自己分离纯化后的细菌菌株
2.试剂
TE、溶菌酶溶液（20mg/ml）、10% SDS、蛋白酶K（20mg/ml）、5mol/L NaCl酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、乙醇
3. 仪器
高速台式离心机、紫外检测仪
4. 其他材料：离心管、无菌吸头、移液器等
[实验步骤和过程]
（一）细菌总DNAD 提取
革兰氏阳性菌DNA提取方法(提取基因组DNA)
1. 3-6ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 弃上清
2. 加0.5ml TE悬浮沉淀,并加75μl 溶菌酶（20mg/ml）溶液，40°C保温30分钟
3. 加50μl, 10% SDS, 5μl 蛋白酶K （20mg/ml）,混匀, 37℃保温30分钟
4. 加0.75ml, 5mol/L NaCl, 混匀
5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 静置10分钟，5000转离心10分钟，转移上清到干净管中。
7. 加2倍体积乙醇沉淀DNA, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，离心沉淀DNA
8. 70%乙醇漂洗DNA后, 吸干, 用30-50μl TE溶解DNA, -20℃保存
革兰氏阴性菌总DNA提取方法
方法一：
1. 将菌液悬于1.5ml溶菌酶溶液（0.15mol/l Nacl, 0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8）.
2. 37℃温浴2h，
3. 加入1.5ml 10%SDS（0.1mol/l Nacl，0.5mol/l Tris，10%SDS，pH=8）反复颠倒混匀10min，10000r/min离心10min，取上清
4. 用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加入40μl的3mol/l乙酸铵和3ml无水乙醇，-20℃沉淀DNA1h，12000r/min 离心10min
5. 收集DNA沉淀，用100μl TE溶解
方法二：
1. 加入DNA提取液100 mmol/l，（Tris100 mmol/lEDTA，100 mmol/lNacl，1%pvp , 2%SDS，pH=8）旋涡混匀
2. 在摇床上250 r/min振荡2h，4℃沉淀DNA 1 h，13000 r/min离心10min收集DNA 沉淀
3. 用100μlTE溶解DNA
方法三：
1.加入DNA提取液（100 mmol/l，Tris100 mmol/lEDTA，100 mmol/l磷酸钠，1.5mol/l Nacl，1%CTAB，pH=8），20μl蛋白酶K（20mg/ml）和500μl溶菌酶（0.15mol/l Nacl,0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8），37℃温浴2h。
2.加入1 ml 20%SDS，65℃水浴过夜
3.加入1/3倍体积饱和Nacl,剧烈振荡，12000 r/min 离心10min
4.取上清，用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加入等体积TE，再加入0.6倍体积的异丙醇室温沉淀DNA 2h
5.12000 r/min 离心10min收集DNA沉淀，用200μlTE溶解
方法四：
1. 取20μl TE、20μl 饱和酚与无菌小离心管中
2. 取已经培养好的菌一环到上述离心管中
3. 震荡离心管30秒
4. 离心，8000rpm, 10min
5. 取上清3-5 μl 进行琼脂糖凝胶电泳检测
（二）DNA的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应使不同大小的DNA分子分离
把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测
溴化乙锭（EB）在紫外光照射下发射荧光，EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物
[实验材料]
细菌总DNA溶液
电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等
琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液
[实验步骤]
1.1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀，微波炉加热溶解。
2.将冷却至50℃的凝胶倒入制胶室，插入梳子，室温冷却凝固
3.将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子
4.用移液器吸取总DNA 4μl于封口膜上，再加入1μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔
5.打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min
6.电泳结束后取出凝胶，置EB 溶液中染色5~10min，清水漂洗
7.将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带
制胶
加样
细菌总DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带，前端有大量RNA分子
[注意事项]
1.EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。
2.总DNA提取过程中，离心管不可剧烈震动，防止过多的断裂。
附：背景资料
琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
（2）电泳速度快。
（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。
（4）样品易回收，常用于制备。
4℃保存备用
常用的6X载样缓冲液
Ⅰ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液
Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液
