组织DNA的提取和纯化原理、试剂和操作

2010-03-11 13:56 · cash

[原理] 本法用含EDTA的溶液洗涤细胞,SDS(十二烷基硫酸钠)破碎、裂解细胞,消化蛋白质,使核蛋白解聚并使细胞内的DNA酶失活,用酚、氯仿变性蛋白质并去除杂质,最后用乙醇沉淀得到纯化的DNA。 [试剂] 1.裂解缓冲液 2.苯酚-氯仿溶液 3.氯仿-异戊醇溶液 4

[原理]

本法用含EDTA的溶液洗涤细胞,SDS(十二烷基硫酸钠)破碎、裂解细胞,消化蛋白质,使核蛋白解聚并使细胞内的DNA酶失活,用酚、氯仿变性蛋白质并去除杂质,最后用乙醇沉淀得到纯化的DNA。

[试剂]

1.裂解缓冲液

2.苯酚-氯仿溶液

3.氯仿-异戊醇溶液

4.冰无水乙醇及70%乙醇

5.TE缓冲液

6.5mol/L NaCl

[操作]

1.处死小白鼠一只,取新鲜肝脏,用生理盐水清洗去血水。

2.每克组织加10ml裂解液制成匀浆。

3.取2ml匀浆于离心管中,加等体积苯酚-氯仿溶液,加盖,缓缓来回颠倒5min,离心2500rpm×10min。

4.取上层水相,加等体积氯仿-异戊醇溶液,加盖,缓缓来回颠倒5min,离心2500rpm×10min。

5.取上层水相至玻璃管内,加5mol/L NaCl至终浓度为0.3mol/L(2ml 100μl,3ml 150μl)。

6.加2.5倍体积的冰无水乙醇,加盖,缓慢摇匀,见白色絮状沉淀DNA出现。

7.用玻棒捞起DNA沉淀置于试管中,用1mlTE溶解。

8.定量

吸取DNA溶液100μl 2.9mlTE(30倍稀释),在260nm和280nm下读取吸光度值,

9.计算

DNA浓度(ug/ml)=A260 nm×50×1/光径×稀释倍数

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