目 的
1．为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA。
排除自身环化。鉴定方法主要有：
（1）PCR法及其利弊。采用载体两端的引物进行PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。
（2）Southern blot法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作Southern blot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。
（3）酶切鉴定法及其利弊。
2．提供一定数量的DNA以满足一些实验，比如1）测序、2）准备杂交用的探针。这便是本实验的两个主要目的。
有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似，区别在于DNA的回收不是采用酒精沉淀，而痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续的工作困难。
原 理
挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后，得到质粒DNA。
实验准备
一．器材
Falcon 2070管
台式Eppendorf管离心机
可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头
经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架
定时器、记号笔、一次性手套和筒纸
4℃和－20℃冰箱
煤气灯或酒精灯
恒温培养摇床（调至37℃，240rpm）
台式4℃ Eppendorf管离心机
离心真空干燥器
37℃水浴
二．试剂
含抗生素的LB培养液
TE（10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0）
100％预冷乙醇
75％预冷乙醇
目 的
1．为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA。
排除自身环化。鉴定方法主要有：
（1）PCR法及其利弊。采用载体两端的引物进行PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。
（2）Southern blot法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作Southern blot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。
（3）酶切鉴定法及其利弊。
2．提供一定数量的DNA以满足一些实验，比如1）测序、2）准备杂交用的探针。这便是本实验的两个主要目的。
有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似，区别在于DNA的回收不是采用酒精沉淀，而痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续的工作困难。
原 理
挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后，得到质粒DNA。
实验准备
一．器材
Falcon 2070管
台式Eppendorf管离心机
可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头
经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架
定时器、记号笔、一次性手套和筒纸
4℃和－20℃冰箱
煤气灯或酒精灯
恒温培养摇床（调至37℃，240rpm）
台式4℃ Eppendorf管离心机
离心真空干燥器
37℃水浴
二．试剂
含抗生素的LB培养液
TE（10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0）
100％预冷乙醇
75％预冷乙醇
RNase （10mg/ml）
3M NaAC
溶液I
50 mM 葡萄糖
25 mM Tris.Cl （pH 8.0）
10 mM EDTA （pH 8.0）
在10 lbf/in2（6.895*104pa）高压灭菌15分钟，贮存于4℃。
溶液II
0.2 N NaOH
1％ SDS
溶液III
5 M 乙酸钾 300 ml
冰乙酸 58 ml
水 142 ml
存于4℃。
消毒过的双蒸水
三．实验材料
含阳性菌落的培养皿
碎冰及碎冰保温盛器
实验步骤
1．第一天（通常为下午）
从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到Falcon管内的5ml LB培养液（含氨卞青霉素）中。放入37℃恒温摇床，225-250 rpm剧烈摇晃培养过夜（O/N）。
2．第二天（通常上午开始）
（1）吸取1.5ml培养液，移入Eppendorf管中，台式离心机室温下1.4万转离心2分钟，弃上清，重复一次，以取得较大的沉淀。剩余培养液存入4℃冰箱。
（2）弃上清，加入100ul溶液I，盖上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架面上，划15下），充分浮悬细胞沉淀，置-20℃冰箱内5分钟。
（3）自冰箱中取出试管，加入200ul溶液II，轻轻颠倒混匀，放于冰上5分钟。
（4）加入150ul溶液III，轻轻颠倒混匀，放于冰上15分钟。
（5）放入台式离心机，室温下1.4万转离心3分钟，将上清移入一新的Eppendorf管，加入1ml 100％乙醇，混匀，放入-20℃冰箱5分钟。
（6）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心5分钟，小心弃去上清，倒置试管于纸巾上流尽乙醇。
（7）加入300ul TE和2ul RNase，重浮悬沉淀，放试管于37℃的水浴中温育30分钟。
（8）加入3M NaAC 34ul，混匀，加入1ml预冷的100％乙醇，-20℃存放5分钟。
（9）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心5分钟，弃去上清。
（10）加入1ml预冷的75％乙醇，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心10分钟，弃去上清。
（11）旋转真空干燥10分钟。于冰上，溶解沉淀于20ul水中。
实验结果
通常可获得3~5ugDNA。
